Хистохимични методи - на базата на хистологията

За дълго време за изучаване на химичния състав на клетки и тъкани, използвани изключително класически биохимични методи, които се базират на общия брой на някои химикали в натрошен тъкан (хомогенат). Все пак, въпреки техните положителни качества, тези методи не осигуряват пълна картина на локализацията на някои химикали в различните структурни компоненти на клетки и тъкани. Търсенето на методи, чрез които да се определи локализацията на химикали в цялостен микроструктури на органи и тъкани, са довели до създаването на хистохимично метода, комбиниране на хистологичните и биохимични методи.
Когато хистохимични реакции на неорганични и органични вещества, съдържащи се в клетките реагират химически с различни реагенти (багрила) и образуват цветни реакционни продукти. Според степента на интензивност на тези продукти може да се съди до известна степен, и количествените съдържанието на химически вещества в дадена структура. В основата на повечето хистохимическите реакции са общи принципи.

1. Някои химични групи са оцветени в някои багрило. Например, РНК фосфатни групи образуват с основни багрила (pyronine, толуидиново синьо и т.н.). Saltlike оцветени съединения.
2. Багрилото се разтваря в определен субстрат, който е част от клетъчни структури. Така например, цвета на мазнини включвания в клетката се основава на разтваряне на Съда на мазнини капката.
3. Някои химични компоненти на клетки, такива като ДНК, полизахариди, са в състояние да реагират с багрилата. В такива случаи прибягват до превръщането на техните химични групи в реакционно-активно състояние (ДНК хидролиза със солна киселина, окислението на полизахариди йодна киселина). Това освобождава новосъздадените или химични групи, които са способни на взаимодействие с подходящи реагенти, при което се образува продукт цвят реакция.
4. При определяне локализацията на определени клетъчни компоненти прибягват до многоетапен реакции и посредник трансфер безцветни до продукт на цветна реакция. Например, както е получено в хистохимични оцветяване ензими (за подробности виж. По-долу).

Новият метод се използва широко в изследователската практика. В момента не морфологична лаборатория е пълна без използването на хистохимическите техники. Въпреки това, успешното притежаването изисква усвояване на определени умения и при спазване на определени условия, за разлика от хистологичните техники, облечен предимно емпиричен характер, хистохимични въз основа на определени химични механизми и да има строга специфичност. Следователно, основното изискване - специален точността и пълнотата в работата си. Критерият за оценка на резултатите на хистохимично реакция е не само локализацията на химически вещества, но също така и интензитетът на цвета на компонентите на изпитване на клетки и тъкани, както е показателно за концентрацията на откриваеми вещества. Ако хистологично обработване на материал може да бъде някои отклонение в оцветяващия препарат, използвани за подготовка на материала и на хистохимични реакции методи трябва да се наблюдават внимателно, като отклонения на всеки етап може да се променят по време на реакцията, и в крайна сметка водят до неправилна оценка на лекарството.
За да създадете подходящи условия на химически реакции, трябва да се обърне специално внимание на подготовката на работните разтвори, както и чистотата на съдовете и чашите, качеството на реактивите, и така нататък. Г.
Понастоящем хистохимия включен проучвания количествени ниво с помощта на специални устройства (tsitospektrofotometrov), което позволява достатъчно точно да се определи количествено характеризиране на интензивността на цвета (на продукта), което е особено важно за оценка на метаболитната състоянието на изследваните органи, тъкани и отделните клетки. Това е още повече поставя високи изисквания към качеството на хистохимическите реакции и спазването на строга стандартизация на лечението, в сравнение предмети на всички етапи. Това е за тези цели се използва предимно комбинация от сравняваните проби в един блок, последвано от получаване на филийки равномерна дебелина на стъкло (вж. Стр 178) .При това не е възможно, е необходимо в секциите на рязане, разположени на различна слайд. С всеки метод на комбиниране на сравнение секции излагат всички етапи хистохимични реакции едновременно, използвайки същите реагенти части.

Буфери и тяхната подготовка

Химични процеси в тъканите на тялото, по-специално включващи ензими изискват наличието на редица условия, включително рН на средата е от съществено значение. Както е известно, степента на киселинност на разтвора зависи от концентрацията на Н + йони, и неговата степен на алкалност - концентрацията на ОН-йони.
При определена температура на продукта от положително и отрицателно заредени йони - константа. Знаейки, един от показателите, че е възможно да се определи, от друга. Като се започне от тази позиция, в химията обикновено обозначен с киселинност или алкалност на разтвора през водород условно показател (рН), представляващ логаритъм на концентрацията на Н + йони, взети с обратен знак. По този начин, при рН 7,0 Н + йон концентрация равна на концентрацията на ОН йони" и разтворът има неутрална реакция. Индикаторът за рН е по-малко от 7.0, концентрацията на Н + йони горе (фигура защото с обратен знак), и по-голяма киселинността на разтвора. Обратно, рН повече от 7.0, по-ниска Н + йони в разтвор и неговите по-изразени алкални свойства.
необходими различни ензими за проява на дейността различни стойности на рН. Така, оптималната условие за действието на алкална фосфатаза при рН 9,0, докато кисела фосфатаза изисква рН 5,0 на.
За да се осигури най-добрите условия за активност хистохимично откриваем ензим, е необходимо в инкубационната среда се поддържа стойност на рН оптимално за ензима. Това състояние се постига чрез въвеждане в буферни смеси инкубационната среда с определено рН. Най-честите буферни разтвори са фосфат, ацетат и Tris буфер.

Получаване на буфери

Преди да предписание буферни смеси, трябва да се припомни, че за да се определи концентрацията на реагента разтвор взети понятия моларността на (М) и нормалността (N).
Разтвор моларност (М) - броят на грам мола вещество, съдържащо се в 1 литър разтвор. Грам мола - молекулно тегло на веществото, изразени в грамове. Например, за да се получи разтвор с концентрация от 0.2 М до 1 литър трябва да разтвор агент в количество, равно на 0,2 на неговото молекулно тегло.
Нормалност (N) - броят на грам-еквивалента в 1 литър разтвор. Ekivalent грама количество от веществото е химически еквивалент в реакция 1 грам атом на водород. Ето защо:

Фосфатен буфер (рН 6,0-8,0). Решения: А - 0.2 М КН 2РО 4 (13.6 г сол в един литър дестилирана вода) - B - 0.2 М Na2 НРО 4 (31.2 грама Na2 НРО 4, 2H2O в един литър дестилирана вода).
За 100 мл буфер на желаното рН трябва да се източи разтвори А и Б в количествата, показани в Таблица. 3.
Ацетатен буфер (рН 3,6-5,6). Решения: A - 0,5 N СН3 COOH (30 мл ледена оцетна киселина за попълване 970 мл дестилирана вода) - байта - 0,5NCH3 COONa (68 г сол се разтваря в 1 л дестилирана вода). Тигелът разтвори А и Б в количествата, показани в Таблица. 4.
таблица 3

ТАБЛИЦА 4

Tris-буфер (рН 7,2 - 9,0). Решения: А - 0.2 М трис (хидроксиметил) аминометан (24,3 грама на сол в 1 л дестилирана вода) - байта - 0.1 N НС1.
Тигелът посочените количества от разтвори А и Б и зареждане до 100 мл с дестилирана вода (таблица. 5).
Както изходните разтвори, както и себе буферни смеси могат да се съхраняват за дълъг период от време.
Таблица 5

Забележка. Ако се желае да се получи буферен разтвор моларност от описания в това ръководство, само моларността на първоначалните разтвори трябва да се промени, като тяхна количествено съотношение да се получи рН остават непроменени.
Въпреки това, за да се избегнат грешки (качество реагент, неточности в препарата) рН буферирани разтвори, готови да бъдат проверени преди употреба. Твърда проверка може да се извърши с помощта на тест хартия, по-точно - от потенциометър специално устройство (рН метър).

Откриване на нуклеинови киселини

Нуклеинова киселина (съединение макромолекулен комплекс химичен състав) играе ключова роля в жизнената дейност на всички клетки животните и растенията. Рибонуклеинова киселина (РНК) извършва синтеза на протеини и дезоксирибонуклеинова (ДНК) - съхранение и предаване на наследствени черти. Първият се съдържа в цитоплазмата и ядърце, а вторият - в хроматина на ядрата. Също така важна роля на нуклеинови киселини е причина за голям интерес за изследването на тяхното съдържание и разпределение на органи и тъкани. Има няколко начина хистохимично откриване на нуклеинови киселини, но най-широко използваният метод Brachet (за откриване РНК) и метода на Feulgen (за откриване на ДНК).

Откриване на РНК чрез метода Brachet

(Locks може да бъде различен, но най-добрият Carnoy, Бродски и Tsenkera- попълнете парафин)
В момента, този метод е загубил голяма част от предишното си значение се дължи на факта, че в резултат на реакцията не може да се определи количествено tsitospektrofotometre. Въпреки това, този метод все още е доста широко използвани в лаборатории (особено когато има tsitospektrofotometrov) себе си и развитието му дава техник опита в получаването и пречистването на химически разтвори.
Методът се състои в избирателно свързване на някои основни багрила до нуклеинови киселини (в настоящия метод - pyronine на РНК и ДНК метил зелено).
Преди хистохимично реакция бъде чист метил зелено, като търговски достъпен препарат сместа винаги съдържа метил виолетово оцветяване значително нарушаване на резултата. За тази цел, воден разтвор на метил зелено се добавя хлороформ (или амилов алкохол) и затваряне на съда се разклаща енергично. След като сместа се установява в ясно видима два слоя - горна тъмни представляващ воден разтвор багрило и долна виолетови - хлороформ оцветяват с метил виолет. Изтичането внимателно воден разтвор се към нея отново хлороформ и цялата процедура се повтаря добавя. Изпирането на производството, докато хлороформа вече не е боядисана в лилаво. Почистват и се суши препарат може да се съхранява за дълъг период от време.
Работещи решения
Разтвор А: 5% воден разтвор на pyronine 17.5 мл, 2% воден разтвор на метил зелени 10 мл, 250 мл дестилирана вода.
Разтвор В: 0.5 М ацетатен буфер рН 4,8 (получаването виж s.265.).
Преди употреба, равни обеми декантира разтвори А и Б (съхранява не повече от една седмица).
Метод. 1. 5-7 микрона парафинови срезове се депарафинират в дебелина и доведени до вода.

1. Поставете разтвор в метил зелено - pyronine (от 100 минути до 20 часа).
2. Изплакнете в продължение на няколко секунди в дестилирана вода (удължаване изплакване води до извличане pyronine).
3. Суха филтърна хартия.
4. Бързо движите абсолютен ацетон и сместа от равни части ацетон и ксилол, ацетон 10% разтвор в ксилен.
5. Освети две части ксилол и сключва в балсам.

Резултати. РНК нуклеоли и цитоплазмата ярко червени ядра хроматин зелено или синьо-зелен.
За да се провери специфичността на оцветяване РНК даде паралелно контрол хистохимично реакция. За тази цел, от специална обработка на секциите на РНК се отстранява, при което метил зелено оцветяване - pyronine схемата, описана по-горе.
Резултати. Оцветяване pironin случва, метил зелено - отслабена.
Най-добрият начин е да се премахнат секции лечение РНК ензим рибонуклеазните (0.1-0.5 мг кристален рибонуклеаза в 1 мл дестилирана вода) за 2-3 часа при 56 ° С
При липса на екстракция рибонуклеаза РНК може да се осъществи чрез поставяне на парчета в разтвор на студен 10% перхлорна киселина (HCIO4) в продължение на 3-6 часа.

Реакция gallocyanin и хром стипца с нуклеинови киселини (РНК и ДНК) чрез Einarson
(Бродски ключалки Carnoy)
Този метод е в контраст с метод Brachet по-прост, надежден и позволява да се определи количествено съдържание на нуклеинови киселини с помощта на модерна tsitospektrofotometrov, като по този начин се използва широко.
Получаване на разтвор багрило
Разтваря се 5 г хром стипца (подходящи само полупрозрачни лилави кристали) в 100 мл дестилирана вода. Добави 0,15 гр gallocyanin и се смесва чрез разклащане. Постепенно нагрява и доведен до кипене. Оставя се да кипи в продължение на 5 минути. Охлажда се до стайна температура, филтрува се, и се добавя дестилирана вода, добавяне на обема на филтрата до 100 мл. Проверка на рН (трябва да бъде 1,64)
Провеждане на реакцията: да донесе на секциите или петна на вода. Оцвети за 48 часа при стайна температура. Едно бързо изплакване, дехидратират и сключва в Balm.
Резултати. Това оцветява РНК и ДНК. 11eet структури, съдържащи нуклеинова киселина от светло синьо до сив, в зависимост от марката на багрилото. нуклеаза използва за разделяне на РНК и ДНК (виж метод Brachet).

Идентифициране на ДНК метод Feulgen

(Различни клипове, но най-добрият Carnoy, Tsenkera- попълват парафин)
Същността на метода е, че ДНК молекули разцепване продукти, извършени в слабо кисела среда, съдействие с фуксин безцветно киселина (реагент на Шиф), образува комплекс с цвят магента. По този начин, локализацията на реакционния продукт показва място хистохимично ДНК и цвят интензитет - неговата концентрация.

Видео: дебелото черво. Дебелото черво. В светлинен микроскоп

реагент Шиф. Разтваря се 1 г основен фуксин в 200 мл кипяща дестилирана вода и понякога разклащане на съда с разтвора, да кипи в продължение на 5 минути. След охлаждане съдържанието до 50 ° С, разтворът се филтрува, 20 мл 1N разтвор на НС1 и се охлажда до 25 ° С, след което се прибавя 1 г натриев метабисулфит (Na2S2O 5) или калиев (K2S2O5) и се оставя на тъмно. След 18-24 часа, изсипва се 2 г активен въглен в разтвора се разклаща в продължение на 1 мин, филтрува се и се съхраняват на тъмно при 0-4 ° С реагент Готов Schiff е безцветен или има бледожълт цвят. Зачервяване на разтвора по време на съхранение предполага неговото разширение и негодни за консумация.
Трябва да се има предвид, че понякога на пазара се доставя недостатъчно пречистени основен фуксин. Ето защо, ако приготвения разтвор не отговаря на изискванията, трябва да се вземе главната магента новата партия и отново се подготвят с реагент.
Odnonormalny разтвор на солна киселина (1N). Към 10 мл концентрирана солна киселина (гъстота 1,19) се прибавя 90 мл дестилирана вода. Разтворът може да се съхранява дълго време.
Сулфит вода за промиване на секции. Към 5 мл 10% разтвор на калиев бисулфат (K2S2O5) се прибавя 5 мл разтвор на 1 N НС1 и се долива с дестилирана вода до 100 мл. Разтвор на калиев бисулфит може да се използва в рамките на 7 дни, сулфит същата вода се получава преди употреба и се използва веднага.
Метод. 1. 5-7 микрона парафинови срезове се депарафинират в дебелина и доведени до вода.

1. Бързо се изплаква със студена IN НС1.
2. Поставете в IN НС1 при 60 ° С в продължение на 6 минути (чаша се поставя във водна баня).
3. Бързо се изплаква със студена IN НС1 и след това с дестилирана вода.
4. Сложете в реагент Шиф за 40-60 минути.
5. Тигелът филтърна хартия и се промива с три порции от прясно приготвен сулфит вода за 1-2 минути.
6. Изплакнете в чешмяна вода до около 10 минути (ако е необходимо dokrasit цитоплазма: парче се поставя 1-1.5 минути в 1% воден разтвор на бледо зелено или 0.5% алкохолен разтвор на силна зелено).
7. Дехидратирайте, просвети и да сключи в балсама. Резултати. Парцели ядра, съдържащи ДНК се оцветява в червено лилав цвят (светло зелено цитоплазма).