Идентификация на нервните клетки от жизнено оцветяване с метиленово синьо - основа на хистология

Определяне на материал, произведен след оцветяване, следователно всички работни разтвори както за багрене и за определяне трябва да бъдат подготвени предварително.

Работещи решения

Първо се получава концентриран 1% син разтвор метилен. В 100 мл течност Рингер - Лок разтваря 1 г метиленово синьо. Разтворът може да се съхранява дълго време. За боядисване това се разрежда с течни няколко пъти Ringer-Лок.
Течен Рингер - Лок като izotoniche9komu разтвор съдържа натриев хлорид вещества в животинските тъкани. Когато се работи с бозайници може да се консумира течност Рингер - Лок следния състав.

Ако подходящо оборудване е на разположение, течният Ringer - Лок преди експеримента може да бъде наситен с кислород, което подобрява живота на нервните клетки оцветяване.
необходимо да се използват химически чиста кристална препарат за метилен разтвор синьо багрило, което е двойна сол hlortsinkovuyu или медицинска употреба химически чиста метиленово синьо, лишена от цинков хлорид.
За определяне материал се консумира пикрат разтвори на амониев или на амониев молибдат. Използвайте само кристален амониев молибдат (7.5 г от тази сол се разтваря в 100 ml дестилирана вода, след което се филтрува разтвор).
Амониев пикрат се разтваря в количество от около 1 г на 100 мл затоплен (60 ° С), дестилирана вода. Подгответе трябва разтвор непосредствено преди експеримента. Използвайте червен изомер на солта. Към този разтвор 25% амоняк се загрява на водна баня (в качулка!) И след това се прибавя на малки порции към кристален пикринова киселина, докато разтворът стане наситен (т. Е. до разтваряне спира). След допълнително нагряване на разтвора върху повърхността изглежда тънък филм от малки кристали. След това отопление е спряно. Охлаждането трябва да се извършва бавно (на водна баня или обвивка колба кърпа). След 12 часа, течността се отдекантира и получените кристали на амониев пикрат веднага се разтварят в дестилирана вода до получаване на наситен разтвор (сухо амониев пикрат трябва да се работи с голямо внимание, тъй като при енергично разбъркване и се загрява експлозия може да се случи). се добавя дестилирана вода, за да остане в долната част на достатъчен брой кристали, т.т.. Е. Разтворът се насища. Преди употреба, двата разтвора се охлаждат до 3-5 ° С като се използва разтворът отново се прибавя дестилирана вода до насищане.

оцветяване

Техниката разработен от А. С. Dogiel. Има различни методи за въвеждане на багрило в тялото, нервната елементи, от които се очаква да открие. Метиленово синьо разтвор се въвежда през кръвоносните съдове или изрязва от орган на тялото се поставя директно в разтвора на багрило. Има и други начини: в телесната кухина (торакална, коремна) инжектира багрилото, в който основно боядисани нервните елементи на серозни мембрани и след това (при метиленово синьо отива в кръвта), и други органи. Багрилото се инжектира директно в тъканта на тялото на тест. Първите два метода е по-вероятно.
Евтаназия на животните с помощта на анестезия, е необходимо да се изложи основен артериална съд най-близо до тялото, нервните елементи, които са оцветени. Например, за да се открие невронни елементи на долния крайник, излагане на абдоминалната аорта малко над неговата бифуркация, в областта на главата на инжектиране - .. артерия каротидна във врата, и т.н. В малки животни (плъхове, морски свинчета, зайци, котенца) канюла се вкарва директно в аортата , Съдът беше като на лигатура около мястото на инжектиране (по-близо до сърцето) и се свързват. Изрязвам съда се вкарва в канюлата има подходящ размер и да засилва лигатура. А гумена тръба (снабдена с клип) канюла свързан към съда, в който течността се излива Ringel-Лок, загрята до температура от 37 ° С Преди да влезе в канюлата, че е необходимо, с помощта на скоба, за да запълни целия тръба течност и канюлата. Съд с течност Рингер - Лок засили приблизително 70 cm над нивото на канюлата, отворена скоба и подаде към контейнера за промивна течност. Ако такава инсталация за измиване (и последващо въвеждане на боя) невъзможно да събира, на Рингер - Лок и метиленово синьо, може да се прилага в съд спринцовка, гумена тръба свързване към канюлата.
По този начин, след промиване и се инжектира разтвор на метиленово синьо, загрява се до температурата на тялото на животното (в размер на 15 мл 1% разтвор на метиленово синьо в 1 литър течност Рингер - Лок). багрило време на инжектиране трябва да се определи емпирично. За тази цел парченца тъкан инжекционни район, разположен между два слайда и при ниско увеличение контролират процеса на боядисване на невронните елементи. Обикновено цветът не надвишава 40-50 минути. След инжектиране е пълен, тялото се отваря и се оставя в продължение на 2-3 минути във въздуха (в присъствието на кислород се увеличава петно ​​нервните клетки).
След това на малки парчета орган изрязват и се поставят в термостат при 37 ° С в продължение на оцветяват. За тази цел, на дъното на чашата се поставя филтърна хартия, навлажнена със същия разтвор багрило, което се използва за инжектиране, и повърхността на обекта от разтвора на багрило се прилага на капки. Провеждане на малка част от тялото между двете пързалки, контролира процеса на оцветяване под микроскоп.
Можете да направите оцветяване чрез потапяне на тялото в боята. Този метод се използва често, когато се работи с фините тела, като стените на кухите вътрешните органи. Парче тяло се нарязва, изправяне, поставени | в блюдо на Петри върху филтърна хартия и след това се излива в разтвор на метиленово синьо в Ringer на течност - Лок. И за да наблюдава напредъка на оцветяване под микроскоп.

Фиксиране и заключение

След оцветяване с метиленово синьо трябва незабавно да заснемете обекта, така че е важно да се подготвят предварително и се съхранява в хладилник задържането на течности. Определяне се извършва при температура от 1-3 ° С определяне на времето, зависи от размера на обекта. За тънки слоеве, по време на определяне на разтвора на амониев молибдат е 30 минути - 1 час, разтвор на амониев пикрат -. 3.2 часа плътна обекти фиксирани 12-24 часа.
В някои случаи, използването на двойно заключване: за 30-40 минути фиксирани амониев пикрат разтвор, и след това се прехвърля на един ден в разтвора на амониев молибдат.
След фиксация, парчетата трябва да бъде старателно промити в дестилирана вода, която се заменя 5-6 пъти за отстраняване на кристалите на солта фиксиране. Те след това бързо се извършва чрез 96 ° и абсолютен алкохол, ксилен и вградени в балсам. Ако искате да се готви филийки, след което се изсипва в целоидин. Парафин пълнене е възможно само когато гореописаната последователно фиксиращите двете соли. Мембранни препарати и секции могат да бъдат dokrasit ядрена багрило като кармин стипца. Blued невронни елементи са ясно видими на фона на околните клетки, чиито ядра са оцветени в червено.
Овладяването техники supravital боядисват син метилен е най-добре да се започне с такива обекти, които се идентифицират невронни елементи най-просто и многозначително.
За тази цел, можем да препоръчаме ганглиите на чревната smenki лабораторни животни (най-доброто управление на оцветяване нервните клетки на млади кучета и котки).