Откриване на полизахариди - основа на хистология

Откриване на полизахариди (киселинен и неутрален)*
Полизахариди - високи захари молекулно тегло, се намират в тъканите на организма в чиста форма (гликоген) и в комбинация с други вещества (мукополизахариди mukoproteidov, гликопротеини). Гликогенът е резервен захари в организма и се намира главно в черния дроб и мускулите. Мукополизахариди - полизахарид, съдържащ хексозаминовия като един от компонентите. Те са важен компонент на слузести вещества в организма, защо, и да получите името си (на латински слуз -. Слузта).

* киселинни мукополизахариди сега се нарича гликозаминогликани и неутрални - гликопротеини. Въпреки това, ние си запазваме текста на старите условия, тъй като те се появяват в по-голямата част от съществуващите методическите указания за хистохимия.

Мукополизахариди разделени на неутрални и кисели. Последно широко разпространени в животинския организъм е широко (слуз епител на храносмилателния тракт и най дуктален жлеза, съединителна тъкан алкално вещество, и така нататък. D.), те са от своя страна разделя на прост (хиалуронова киселина) и естери (mukoitinsernaya хепарин и хондроитин киселина). Мукополизахариди, здраво свързани към mukoproteidov и гликопротеини протеин, наречен. Те са част от слузести вещества и секрети от няколко жлези.
Полизахариди и техни комплекси - много лабилни съединения, които са чувствителни към различни промени на метаболитните процеси в организма.
Полизахариди вещества играят важна роля при нормални физиологични процеси и заемат водеща позиция в развитието на редица патологични процеси, особено тези, свързани с заболяване на съединителната тъкан. Поради това, изследването на динамиката на промените в съдържанието и разпределението на различните компоненти на полизахариди в организма е от голямо значение в областта на изследванията и практиката идентификация и диференциация на полизахариди - един от основните раздели на хистохимия.

Реакция - Шиф перйодна киселина (PAS-реакция)

вещества основа хистохимия съдържащи полизахарид компонент е реакцията периодично Schiff киселина (PAS-реакция).
Използването на тази реакция може да бъде открит гликогеновите mukoproteidov, гликопротеини и гликолипиди.
Работещи решения
реагент Шиф (виж по-горе метод за получаване -. 270.).
В серниста водата. Към 200 мл дестилирана вода се прибавя 4 мл концентрирана НС1. В 25 мл дестилирана вода се разтварят 4 г безводен натриев сулфит. И двамата се свърже решение.
Разтвор на перйодат. Разтваря се 1 гр калиев перйодат или натриев перйодат, 2,5 грама в 100 мл дестилирана вода.
метод
(Заключване Shabadash алкохол, формалин, течност Carnoy на пълнене течност Tsenkera- в парафин, замразени секции).

1. Секции 5-7 микрона дебелина депарафиниран и доведени до вода.
2. Потапя в разтвор на перйодна киселина за 5-10 минути, или натриев или калиев перйодат в продължение на 20-30 минути.
3. Изплакнете обилно в две или три порции дестилирана вода (3-5 минути) за да се отстрани остатъкът от йодна киселина.
4. Добави към реагент Шиф в продължение на 10-20 минути.
5. Метод на три порции от прясно приготвен сярна вода (1-2 минути).
6. Изплакнете в чешмяна вода в продължение на 10 мин, промива се с дестилирана вода.
7. Дехидратирайте, просвети и сключва в Balm (ако искате да се боядисват на ядрото, след шестата фаза на секциите на продукция контрастно оцветени с хематоксилин).

Резултати. Полизахариди вещество е оцветен в лилаво или лилаво-червен цвят. Неутрални мукополизахариди обикновено са пурпурночервено, гликоген - по-тъмен.
Забележка. реагент обработка Шиф трябва да се извършва в затворена, биологични чаши, увити в черна хартия. Едната част на реагента може да се използва многократно (до цвета на червеникаво).
Ако парчета показват мръсни-кафяви петна, това показва, че окисляващ разтвор не е напълно промива преди обработка секции Schiff.

Разграничаване агенти, които дават положителна реакция Schick

PAS-положителна реакция, прибавянето на гликоген е групата на веществата -glikolipidy полизахариди, гликопротеини, mukoproteidov, както и някои вещества не съдържат въглехидрати: фосфолипиди, липопротеини и някои липиди. Следователно, за да се определи кои от веществата, присъстващи в тъканите изследвана при всеки случай, допълнителни реакции трябва да се извършват за изясняване PAS-позитивни вещества.
Разбивка на гликоген. Нанесете на крайния продукт или диастазата ензим, съдържащ се в слюнката.
В първия случай с 0.1% разтвор на диастаза 0.02М фосфатен буфер с рН 6,0 се прибавя натриев хлорид (готварска сол) в концентрация от 0.8% в секунда слюнката събрани няколко кубчета и се филтрува в чаша.
Метод. 1. След депарафинизация с вода и регулиране на един или два парче се поставя в диастаза (или слюнка) разтвор и се поставят в термостат при 37 ° С в продължение на 30-60 минути, оставя да престои във водата.

1. Срезовете се промиват в дестилирана вода заедно с други съкращения (нетретирани ензими) и се подлагат на реакция с Schick-горе метод.

Резултати. 1. Липса на оцветяване в раздели инкубират в разтвор, съдържащ ензима (контрола), което показва, че PAS-положителна реакция в другите раздели поради наличието в тъканите glikogena- 2) ако всички секции са оцветени същото, това означава, че гликоген отсъства и багрилни причинени от други вещества, като положителна reaktsiyu- PAS-3), когато секциите на контрол се оцветяват по-малко интензивно, отколкото другите, трябва да се приеме, че част на PAS положителен материал е гликоген.
Ацетилирането реакция. Контролните точки, лекувани в продължение на 1-24 часа при 21 ° С в смес от мл оцетен анхидрид и 24 мл сух пиридин, промива се с вода, лекувани в продължение на 1 час в разтвор на натриев хидроксид (0.4 мл NaOH в 100 мл дестилирана вода), промиват във вода и се провежда Schick реакция. Отрицателните резултати показват, че първоначалната реакция се дължи на присъствието на въглехидратни вещества (1-2 гликол група).

Видео: биология. Откриване на мазнини в зърнени култури. видео 2

липидна екстракция. Срезовете се инкубират тлеещ 29 часа в смес от различни части на хлороформ и метанол при 58 ° С Ако цветът на PAS реакция изчезва или намалява, това се дължи на липидни вещества.
Реакция - Schiff-пероцетна киселина. Частите бяха предварително третирани 1-2 часа в разтвор на пермравчена или пероцетна киселина, и след това се оцветяват с реагент Шиф. Наличието на тези структури, боядисани в червен цвят показва, липиди с ненаситени връзки (фосфолипиди и цереброзиди).
Обработка на секции с трипсин. Ако PAS-положителна реакция изчезва или намалява в филийки предварително третирани с трипсин, след това се дължи на протеинови вещества.

Разкриване на гликоген кармин Най-добрият начин

 (Заключване - Buena, Carnoy, алкохол, формалин, и т.н.).
Работещи решения
Алкалният разтвор на кармин. Разтваря се в 60 мл дестилирана вода, 2 г кармин, 1 г калиев карбонат и 5 г калиев хлорид. Полученият разтвор се кипи в продължение на 5 минути (избягване бързо кипене), охлажда се и се филтрува. След това филтратът се добавят към 20 мл 28% разтвор на амоняк. Се съхранява в хладилник при 0-4 ° С, разтворът негодни за 3 месеца.
Разтвор на кармин за оцветяване. Тигелът 8 мл основен разтвор, 12.5 мл амоняк (гъстота 0,880) и 24 мл метанол (премине 1-2ned разтвор).
Най-доброто решение за диференциация. Към 8 мл абсолютен етанол прибавя 4 мл метанол и 10 мл дестилирана вода.
метод оцветяване (парафинови срези)

Видео: Паун приятели в Минск Zoo.

1. Донесете секции за абсолютен алкохол.
2. Поставете целоидин 1% разтвор за 2-5 минути.
3. Сушени във въздуха.
4. Довежда чрез алкохоли с вода.
5. Dye gemalaunom Ерлих 5 минути.
6. Изплаква се с вода и се диференцират петна ядра в 1% подкислен алкохол.
7. Изплакнете в дестилирана вода.
8. Сложете в кармин за оцветяване решение за 15-30 минути.
9. Най-диференцират в разтвор (без предварително измиване във вода) от 5-10 секунди до няколко минути, докато багрилото стоп отклоняват облак (ако разтворът се замърси бързо, промяната).
10. Изплакнете в 80% алкохол.
11. Дехидратирайте, олекоти и влезте в Balm.

При боядисване tselloidinovyh отрязва първите три стъпки са пропуснати, тъй като те са предназначени да осигурят защита tselloidinovoy секции.
Резултати. Ядрата на тъмно синьо, ярко червено гликоген.
Забележка. Поради факта, че структурата на багрилото включват амоняк, оцветител се извършва в херметически затворени съдове. Контролните точки, лекувани с диастаза като в Schick реакция.