Хистохимично на ензими - основа на хистология

Общи бележки

Ензими - протеинови вещества, които действат като биологични катализатори. Това е от съществено значение за метаболитните процеси в живите организми. Те играят важна роля в осигуряването и регулирането на биохимични реакции в жизнения структури, при което най-ранните етапи на метаболитни разстройства, които водят в крайна сметка до морфологични промени на микроструктури открити чрез конвенционални хистологични методи, се срещат главно в областта на ензимната активност. Поради това е естествено, че се обръща голямо внимание на изследователи, изучаващи състоянието на някои ензими и ензимни системи при нормални и патологични процеси в организма.
Ензимите са строга специфичност за веществата, за които те работят (субстрат), и са активни при определени условия на температура и реакция (рН) на средата (неутрална, кисела и алкална).
Хистохимични проучване на ензим има свои специфични характеристики: а) не разкрива ензима в хистохимично реакцията и продуктът е резултат от взаимодействието на ензима със субстрата (вещество, за което се отразява на ензима) - б) за определяне на действителната локализацията на ензима в микроструктури необходими, продукта от дейността си веднага се утаява под формата на неразтворим съединение, или като резултат от дифузията на фалшиви локализация е получено. В случаите, когато утайка се безцветен, трябва да се преобразува в оцветен продукт, видими чрез микроскоп. Схематично, цялата реакция може да бъде представена както следва:
Ензимът в клетъчната + субстрата -> безцветен реакционен продукт разработчик утаител + ->
- неразтворим продукт цвят реакция
Например:
Алкална фосфатаза в тъканите и нарязани-4- глицерофосфат +
(Ензим) (субстрат)
+ биологични активатори (например, MgCl2) - »освободена фосфат + SaS12 (утаител) -
Са3 (РО4) 2 + Co (NO3) 2 - неразтворим, неоцветен продукт - CO3 (РО4) + (NH4) 2S -
неоцветен жълт sulprodukt амониев famid
- CoS (неразтворим продукт цвят реакция)
В крайна сметка, ние се описание на теста на ензимната активност. Колкото по-голямо количество от продукта, образуван от взаимодействието на ензим и субстрат, толкова по-малко оцветяване структури и следователно по-висока активност на ензима. Обратно, по-слабите оцветяването, ензимната активност е по-ниска.
От по-горе може да се види колко сложно процеса хистохимично определяне на ензимната активност. Това е отразено в методите на преподаване, принципите на които е необходимо да се знае и да се има предвид в този процес.
Така ензим чувствителност към промени в температурата и рН на средата резултатите в значителна загуба на тяхната активност по време на получаването на тъкани за запълване в парафин. Въпреки че има насоки за идентифициране на някои ензими в секциите на парафин, тези методи не са широко използвани, тъй като те не са надеждни, особено на органи и тъкани в няколко насоки, в които активността на ензимите изследвани ниска. Най-добри резултати могат да бъдат постигнати в изследването на секции нефиксирани тъкан, получени в специален апарат - (. S.197 cm) криостат, както и за редица ензими - и участъци получени чрез конвенционален замразяване микротом на тъканта, предварително охладени фиксирани задържащи течности (формалин ацетон). Има и по-сложни начини за приготвяне на блок от нефиксирана тъкан с помощта на специално оборудване.
Специфични характеристики и свойства на ензимите високи изисквания към условията на хистохимично реакция, преди всичко за изготвяне на средата за инкубиране на секции. Свързващите вещества са последната субстрата (специфичен за ензима), буфер (което осигурява определена реакционна среда), вещества, които предотвратяват разпространението на реакционния продукт. Както се изисква в инкубационната среда се въвежда, и други компоненти, които стимулират реакция (активиране на ензимната активност блокира отделните връзки химични процеси и т.н.) на.
Методите са разработени, за да се идентифицират доста голям брой ензими, които са изброени в това ръководство не е възможно. Съсредоточете се само върху някои от най-често използваните в хистологични лаборатории. Те включват методи за идентифициране на активността на редица хидролитични и окислителни ензими.

Идентификация на хидролази

От групата на хидролитични ензими, обмислят начини за откриване на алкална и кисела фосфатаза и АТРаза. Първите две ензими са неспецифични. Те катализира реакцията на прехвърляне на фосфатни групи (трансфосфорилиране) от един до други органични съединения, и също са включени в хидролизата на естери на фосфорната киселина.
ATPase извършва хидролиза на аденозин трифосфат (АТР), която е основен доставчик на енергия за метаболитните процеси в органите и тъканите, поради което изследването на активността на този ензим помага да получите представа за нивото на енергийните процеси в изследваните биологични обекти.
Принципът на откриване на фосфатази е подобен. Ензимът се намира в тъканта, при подходящи условия (рН среда, температура на) разцепва на фосфатни йони от субстрата е в разтвор (органично фосфорно съединение е специфичен за ензима). Предлага се в разтвор на метални йони (калциеви или олово) незабавно се свързва фосфат да се образува неразтворим безцветна утайка, която се отделя на мястото на локализация на ензима. При обработка на части амониев сулфид [(NH4) 2S] утайка става кафяво-черен цвят. Amon сулфид може да се замени с натриев сулфид (Na2S).

Откриване на кисела фосфатаза от Gomory

Нанася замразени срези 10-15 микрона нефиксирана, фиксирани в охладен разтвор на ацетон или 10% неутрален формалин (4-24 часа при 0-4 ° С) тъкан поставен върху слайдове или свободна.
Получаване на 0,05 М ацетатен буфер рН 5,0. Изходни разтвори: А - Разтваря се 1,36 грама натриев ацетат (CH3COONa) в 200 мл дестилирана вода B - 1,5 мл ледена оцетна киселина дестилирана вода отгоре оцетна до 500 мл.
Решенията могат да се съхраняват за дълго време. За да се получи 50 мл ацетат буфер с рН 5,0 е необходимо за изтичане 15 мл разтвор с 35 мл разтвор В.
Инкубационната среда. Разтваря се 1 г (3-глицерофосфат натрий в 50 мл ацетатен буфер (0.05 М с рН 5,0) и след това се добавят 660 мг от оловен нитрат [Pb (NO3) 2]. Получената мътна смес се филтрува.
Получаване на амониев сулфид. [(NH4) 2S]. Към сероводород (H2S) в 200 мл концентрирана NH4 OH, докато поемането на газ престане. След това се добавят още 200 мл концентрирана NH4OH и се разрежда с вода до 1 литър. Насищане на разтвора на амоняк, произведени в капака в добре вентилирано помещение, тъй като и двете съединения имат силна и неприятна миризма. Съд с амониев сулфид трябва да са добре затворени. Разтворът се съхранява в продължение на дълго време.
Амониев сулфид може да бъде заменен с 5-15% разтвор на натриев сулфид. Безцветни кристали от соли, лесно абсорбират вода (Na2S • 9N2O), така че по време на съхранението и стават мокри множествена mucilaginized. За да се получи работен разтвор вземе точното количество кристали се промиват с вода до неприятен мирис на сяра и се разтваря в дестилирана вода (5-15 г на 100 мл вода). Съдът трябва да бъде затворен плътно.
Метод. Поставете парчета в инкубационната среда и се поставят в термостат при 37 ° С за време от 30 минути до 6 часа (в зависимост от прицелния орган). Изплакнете в дестилирана вода. Метод амониев сулфид в продължение на 0.5 минути -1 (срязване се тъмнокафяв цвят). Изплакнете в дестилирана вода (ако е необходимо, dokrasit) и поставени в желатинова-глицерин.
Резултати. Наличието на черно-кафяв оловен сулфид утайка показва наличието на ензима в тъканите.

Откриване на алкална фосфатаза от Gomory

(Фиксиране и секциониране, като за кисела фосфатаза)
Инкубационната среда. Към 10 мл от разтвор на 3% натриев фосфат-глицеро добавят 10 мл 2% разтвор на натриев Medinai, 20 мл 2% разтвор на калциев хлорид (SaS12), 1 мл от 5% разтвор на магнезиев сулфат (MgSO 4) и 5 ​​мл дестилирана вода. Ако източване се появява помътняване филтър. Полученият разтвор трябва да има рН 9,4. Съхранява се в хладилник в продължение на няколко седмици.
Метод. Поставете парчета в инкубационната среда и се поставят в термостат при 37 ° С в продължение на 0.5 -4 часа. Промива се с чешмяна вода и в процеса за 3-5 минути в 2% разтвор на кобалтов хлорид (SoS12). Изплакнете в дестилирана вода и се третира с амониев сулфид (почерняване на срязване). Промива се с няколко порции дестилирана вода (ако е необходимо) dokrasit, дехидратират и освети затворена в балсам.
Резултати. Черно кобалтови сулфидни депозити показват локализацията на ензимната активност.
Тези методи се считат за дълго време
най-предпочитани. Въпреки това, през последните години, те са принудени чрез методи, основани на използването на азобагрила (метод азосвързващата) като методи Gomori не са специфични достатъчно, утайката е груба, изкривяване на реалната картина, особено откриването на алкалната фосфатаза.

Откриване на алкална фосфатаза в Burston

[Замразени среда от свеж материал, фиксиран в продължение на 5-10 минути в хладилник (0-4 ° С) или ацетон в продължение на 1-2 часа в 10% неутрален студен formaline- дебелина 15 микрона]
Основният работен разтвор: 0.25 мл ацетон за разтваряне на 5 мг субстрат (нафтол-A-TK-фосфат) - Добавете 25 мл дестилирана вода, 25 мл от 0.2 М Tris буфер (рН 8,5) и 30 мг на диазониевата сол на (синьо трайно BB). Филтрира.
Метод. 1. сушене секции залепени към стъклото с протеина във въздуха (10-15 минути).

Видео: Структурата на клетката. Структура и функция на клетката. Животът на клетката.

1. Инкубационен в основната работния разтвор.
2. Изплакването в дестилирана вода (да се внимава!).
3. Оцветяват с хематоксилин разрежда.
4. Заключение глицерин-желатин.

Резултат: оцветяващи структури синия цвят, чийто интензитет зависи от активността на ензима.

Идентифициране на АТРаза от метод Vahshteyna - Meisel

(Фиксиране и секциониране същата като тази на откриване на фосфатази от Gomory *)

* Получаване на 0,2 М Tris буфер (рН 7,2).

Инкубационната среда. Разтварят се 25 мг АТР динатриева сол в 20 мл дестилирана вода, добавя се 20 мл 0.2 М Tris буфер (рН 7,2), 1-3 мл 2% -ен разтвор на оловен нитрат [Pb (NO3) 2], 5 мл 0,1 М разтвор на магнезиев сулфат (MgSO 4) и се изсипва 2 мл дестилирана вода. Ако е необходимо, се филтрува, за да се доведе рН до 7.2 (инкубационна среда преди употреба да се подготвят и се добавят съставките в посочения ред).
Метод: 1. Поставете варени филийки в инкубационната среда за 10-60 минути при 37 ° С

Видео: храносмилане в устата

1. Изплакнете обилно в няколко порции дестилирана вода.

1. Метод жълт разтвор на амониев сулфид продължение на 1 минута (появява тъмно кафяв цвят от частта).
2. Бързо изплакнете с дестилирана вода.
3. Включени в желатинови-глицерол или след обезводняване в балсам.

Резултати. Места АТФазата боядисани в кафяво и черно.
Обща бележка за определяне на фосфат. Прекомерното излагане на амониев сулфид може да доведе до разрушаване на ивицата тъкан. Ако измиване след лечение на амониев сулфид причинява бръчки и пилинг филийки препоръчват поставянето им в продължение на 5-10 минути в 6% разтвор на неутрален формалин и едва след това се изплаква с вода, поставени в подходяща среда.

Идентификация окислително-редукционни ензими

Този клас ензими изпълнява важна стъпка в метаболитните процеси на живите организми - биологично окисляване на вещества, произведени по време на метаболизма на протеини, мазнини и въглехидрати.
По време на развитието на биологичното окисляване възниква и натрупване на енергия клетките я използват за извършване на жизнените функции на организма. Този сложен процес мулти-стъпка се извършва последователно през цялата верига, състояща се от ензими и помощни вещества. Същността се състои в разцепването на субстрата от окисляем водороден атом и електронен трансфер на кислород. Когато този атомен кислород влизане в тъканта от кръвта, активира и се комбинира с водороден протон, образува молекула вода.
Така че важната роля на окислителните ензими за осигуряване на обмен на органи и тъкани определя голям интерес към изучаването им. Има три основни групи окислителни ензими: 1) дехидрогенази, които катализират първия етап на окисление, - отнемане водород от субстрата и се прехвърля в междинно окислително tsepi- 2) оксидази, които катализират трансфера на електрони от междинното съединение с kislorodu- 3) пероксидаза, за да се гарантира трансфер електрон пероксиди , Най-широко използвани в хистохимия окисляване ензими, получени чрез откриване на метода на дехидрогенази. Те се основават на собственост на тетразолиеви соли лесно се регенерира (свързани електрон водород) при преминаване от безцветно сол се разтваря във вода в неразтворим оцветен в тъмно синьо кристали формазан минути.
Трябва да знаете, че ако тъканта съдържа голямо количество липиди, те нарушават хода на хистохимично реакция се дължи на окислението на себе си, в резултат на падане груби, с неправилна форма, тъмни, големи кристали. В тези случаи, предварително, секции се поставят в продължение на 1-2 минути към охладен (-5 °, -10 ° С) ацетон.

Видео: хистопатология на хроничен простатит

Идентификация на suktsinatdegidrosenazy Nahlasu

(От секции прясно замразена тъкан бяха подготвени по Криостат и naklennye върху стъклени плочки)
Получаване на изходни разтвори. А - 0.2 М натриев сукцинат (двадесет и седем гр сол в 100 мл дестилирана вода) - B - 0.2 М фосфатен буфер (рН 7,6) - 100 мл (получаването виж s.265.) - В - 30 мг нитроблу тетразолиум (нитро CT), разтворен в 30 мл дестилирана вода.
Инкубационната среда. Тигелът Равни количества от разтвори А и Б и се добавя разтвор на В в количество равно на сумата на първите две.
Метод. 1. Получава в криостат и части бяха изсушени на въздух да се инкубират в инкубатор при 37 ° С в продължение на 10-30 минути.

1. Изплакнете в изотоничен разтвор на натриев хлорид.
2. Поставете в продължение на 10 минути в 10% разтвор на формалин получени в изотоничен разтвор на натриев хлорид.
3. Изплакнете в 15% етанол в продължение на 45 минути.
4. Дехидратирани в алкохоли и сключва в балсам. Резултати. Тъмносин утайка е локализиран в структури, притежаващи ензимна активност.

По същия начин други дехидрогенази активност се открива, промяна само инкубационната среда и средства за влизат в препарати.