Подгответе тъкани за проучвания електрон микроскопски - основите на хистология

Поради факта, че все по електронна микроскопия е част от изследователската практика на морфологични лаборант-хистология изисква минимум от знания е достатъчно да се вземат на материала и да го подготви първите блокове, които след това могат да бъдат обслужени от специалисти с електронен микроскоп.

Общи разпоредби

Принципът на съоръжението за обработка за изследване на електронен микроскоп се основава на същите условия, както за получаването на тъкани за изследване на микроскопа светлина оптичен (фиксиране, измиване, обезводняване, леене, секциониране).
Въпреки това, поради факта, че изследването водят до подмикроскопско ниво, а с помощта на електронен (вместо светлина) греда, като методът за получаване на обекта и техниката за получаване на изключване са някои функции, трябва да сте наясно.

Видео: Методи за изследване на тъканите

1. Необходимо е да се съсредоточи максимално внимание върху това как да се избегне (или максимално намаляване) промени в живите микроструктури, причинени от липсата на кислород и затихване процеси, протичащи при завършване на обекта на живот.
2. Тъй като биологичните мембрани, участващи в образуването на повечето живи микроструктури имат състав липоид-протеин може да използва само тези брави, които не се разтварят липидите и протеините (осмиев тетраоксид, формалин, калиев перманганат). Такива скоби като алкохол, ацетон, живак дихлорид (корозивен сублимиране), унищожаване подмикроскопичните структури невъзможно електрон микроскопско изследване на обекта правят.
3. Дебелината на секциите на изпитване не трябва да надвишава 0,3 микрона (300 NM1), т. Е. Те трябва да бъдат свръхтънки. изображение обект в електронен микроскоп възниква по силата на различни степени на отклонение (дисперсия) електрони, когато те преминават през различни нарязани плътност части, така че по-голяма от дебелината на срезовете за основното изображение ще бъдат насложени изображения на отделните парцели, разположени по-горе (в посока електронен лъч), които винаги Това води до загуба на яснота.
4. необходимо да се получи свръхтънки секции, че материалът за пълнене притежават определени свойства (еластичност, плътност, прозрачност и т.н.). Обикновено, за електрон микроскопски изследвания обект излива в синтетични (полимерни) среда: епокси и полиестерни смоли, а в някои случаи и желатин.

1). Nm (нанометър) -1 / 1000mikrona.

Видео: Човешки раменете анатомия и ръцете, част 1

Като материал и фиксиране

В основата на определяне съединение е осмиев тетраоксид с различни обекти структури. Директен засяга реагент върху тъканта не може да бъде, защото има значителни промени в своите структурни компоненти. Ето защо, на процеса на фиксиране се разделя на два етапа: предварително определяне и postfiksatsiya. За по-добро структури за безопасност, за да се прилагат реагенти притежаващи специално рН и изотоничност, които стойности са определени изглед фиксират тъкан. За префикс прилага буфериран разтвор глутаралдехид (обикновено 3% концентрация). Postfiksatsiyu извършва в 2% разтвор на осмиев тетраоксид.
Преди да се пристъпи към вземат материала, трябва да се подготвят всички необходими решения.
Prefiksator: 0.1 М фосфатен буфер (рН 7,4) се добавя 1% разтвор на калциев хлорид (размер на 0,5 мл на 100 мл буфер). За да се избегне образуването на утайка, последната се прибавя на капки, периодично разклащане (без калциев хлорид буфер може да се съхранява за дълъг период от време, с калциев хлорид - до 2-3 дни). След това, въз основа на това се получава 3% разтвор на глутаралдехид.
Postfiksator: 0.1 М фосфатен буфер (рН 7,4) се добавя осмиев тетраоксид и разтвор на глюкоза (за създаване на изотоничен разтвор), съгласно следната рецепта: 14 мл 6,71% Na2H PCL N2O- 8,5 мл 2,52% NaOH - 5,5 мл от 5,4% разтвор glyukozy- 27.5 мл 2% разтвор тетраоксид osmiya- 0,3 мл 1% разтвор на калциев хлорид.
Получаване на 2% разтвор на осмиев тетраоксид изисква специално внимание. Флаконът с осмиев тетраоксид старателно се промива и след това nadpilivayut чрез изплакване с дестилирана вода, се поставя в чиста колба напълно тъмно, което се излива в дестилирана количество вода, необходимо за да се получи 2% разтвор. След почистване на стъклена пръчка разделение на ампулата (под вода). Бистър разтвор е леко жълтеникав (разтвор може да се съхранява дълго време в студа се утаяват кристали тъмно).
Освен горните реагенти, трябва да има батерия алкохоли възходящи концентрации (50, 70, 80, 95 и 100%), като най-често използваната среда леене - и епоксидна смола Ероп Araldite - неразтворим във вода и материал преди изливане е необходимо да се дехидратират. Поради факта, че малки количества от използваните разтвори (5-10 мл) по време на обработка, се препоръчва да се използва съдовете на подходящ капацитет (например, бутилки от пеницилин).
Като необходимите реагенти, капсулиращият среда и желатинови капсули (№ 1 и 2) може да бъде готов да започне.
Има два основни начина на фиксиране: 1) живот органи перфузия разтвор на 3% глутаралдехид и 2) чрез импрегниране на малка част от тялото на тест. Вторият метод се използва по-често, тъй като това е технически по-лесно и изисква по-малко оскъдни реагенти. Едва след като всички подготвителни работи могат да започнат да се вземат на материала и да го отстраните. Това се прави по следния начин. фиксирани и анестезират с Nembutal или етер (първият метод е за предпочитане) животните. След това, достъпът до целевия орган (в този случай животното трябва да диша и сърцето му работи добре).
Предварително определяне: подлагане на повърхността на тялото на спринцовка прилага към него 25-30 мл 3% разтвор на глутаралдехид в, изрязва след 5-10 мин остър бръснач тънък (1 mm) на тъкан лента и земята в prefiksatora капки, излива се в плексигласова плоча (количество от нарязани парчета плата не трябва да бъде повече от 1 mm3). След пипетата се събира парчета prefiksatora капчиците се прехвърля в бутилка претегляне с нова порция prefiksatora и се поставят в продължение на 1-2 часа в хладилник. След това парчетата плат се промиват четири порции фосфатен буфер с калциев хлорид в продължение на 15-30 минути, и да се пристъпи към следващата стъпка.
Всички тези и последваща манипулация трябва да се извърши възможно най-бързо и при температура 0-4 ° С, което по време на обработката на ястия с разтвори се поставя в чаша с лед.
Postfiksatsiya :. парчета тъкан се поставят в postfiksator продължение на 2 часа след измиване фиксиращия продукция на четири порции от прясно фосфатен буфер с калциев хлорид в продължение на 5 минути.

Дехидратация, импрегниране и пълнене

Дехидратация: парчета тъкан фиксирани и промива се прекарват през батерията увеличава концентрацията на алкохол в следния режим:
Алкохол 50% три порции "70%" "

в студа
Ако е необходимо, на този етап е възможно да се проведе на обекта 24 часа.
Алкохол 80% три порции
"96%" "
"100%" "

при стайна температура
След това се пристъпи към импрегниране и пълнежа.
Понастоящем няколко методи се използват за запълване на синтетична среда (Araldite, Ероп, метакрилати, vestopal и др.).
Това е един от най-често използваните методи за импрегниране и пълнене в Ероп.
За тази цел се приготвя брой съединения.
Смес А: Ероп 812 (62 мл) + Ероп DDSA (100 мл).
Смес Б: Ероп 812 (100 мл) 4- Ероп MNA (89 мл).
Поради факта, че компонентите, които трябва да се смесват вискозна консистенция, трябва да ги разбърква внимателно, в процеса на готвене. Всяка смес може да се приготви за бъдеща употреба и се съхранява в хладилник в продължение на 1-2 месеца.
Преди употреба, равни количества да бъдат смеси А и В и добавя реагент-DMR-30 * (на базата на смес от 10 мл А + В 0.2 мл DMR-30), отново се смесва добре, за да се получи хомогенна маса.

* Срокът на годност на всички компоненти, използвани синтетични медии не трябва да надвишава 1 година.

Импрегниране: изведе парчета в среда от 100% алкохол и общата смес Epona. (А + В = 1: 1) 1 час, след притежават три порции цялата смес Epona (A + B = 1: 1) за 1 час всеки.
В този импрегниране финала и да преминете към следващата стъпка.
Пълнеж: дозира чрез пипета капсули, предварително изсушен в пещ, цялата смес Epona (A + B = 1: 1). Импрегнирани със смола стъкло плат парчета улавяне линия или тънки извити форцепс и изложени един по един във всяка капсула. Без да парчета утаяват на дъното на капсулата се поставя в термостат за полимеризация. Изпичане е следният: 1), при температура от 35 ° С -24 СН2) 45 ° С - 24 CH3) 60 ° С - 24 часа.
Тогава полимеризирани единици извадени от фурната. След 1-2 дни на блоковете се промиват от желатинови капсули. За тази цел те се поставят в буркан с гореща вода за 10-20 минути. Готовите блокове притиснати в blokoderzhatel ultratome на ден, в пирамида изострят и да започне рязане на материала.

Видео: Диагностика и мониторинг на резултатите в образователния часовете по биология в основния училище