Използването на спектроскопски методи за анализ - biomaterialovedenie - Полимери медицински цели

Сред методите за инструментален анализ, използвайки физикохимични методи [26], спектроскопия особено важна роля. В областта на биохимията, включително клиничен анализ, обикновено се използва IR и UV спектроскопия проучване на видимия спектър, анализ флуорография, лазерно Raman спектроскопия, утаяване въртене спектроскопия, кръгов дихроизъм, NMR спектроскопия, електронен спин резонансна спектроскопия и други методи за анализ. Всички те са практикува успешно в mikrokolichestvennogo, качество и структурно определяне на различни високомолекулни вещества като протеини и нуклеинови киселини в разтвор и в други състояния на агрегация.

IR спектроскопия отражение

Общите принципи, методи и целите на IR спектроскопия са добре известни и авторът се отнася читателя да литературата в тази област [26, 27, 28].

Фигура 71. Схематично отражателна инфрачервена спектроскопия чрез схема (ATR). А - среда с висок индекс на пречупване (призма ATR) - байта - проба (полимерен филм).
Фиг. Схема държач призма 72. IR спектрограф работи съгласно метода ATR.
С 1 - 2 подкрепа plastina- - запечатване prokladka- 3 - пробата при празен под формата на 4 - адаптиране vint- 5 - фиксиране винт.
Ето това е препоръчително да спомена само някои конкретен аспект на спектроскопията на метод на отражение (ATR). Принципът на неговото изпълнение се характеризира с диаграмата на фиг. 71- работна част спектрограф, работещ на принципа на ATR, е показана на Фиг. 72.
А призма за създаване на отражения обикновено са направени от материал, който е прозрачен и има висок индекс на рефракция в измерените дължини на вълните (N) в анализирания полимера. Такъв материал (KRS) се състои от смес от кристали T1i-T1Vg (при 4 mm, п = 2,38), AgCl (X = 2,00), Ge (X = 4,10) и някои други компоненти. А отразяващ призма плътно притисната между повърхностите на пробите под формата на полимерен plenok- ако ъгълът на падане надвишава критичната стойност, т.е.. E. 0 ° = = sin_1, общо отражение се генерира. Определяне на абсорбцията на отразения лъч осигурява повърхностна част на ИЧ спектър на пробата (дълбочината на същия ред като дължината на вълната на дължината на вълната на падащата светлина). По този начин, като се използва специфична характеристика отражение спектроскопия може да определи вещество се отлага върху повърхността на полимера при изследване, по-специално протеини, адсорбиран върху него.
Lyman и сътр. [29] IR спектроскопия отражение се използва за количествено определяне на адсорбция на плазма протеин на филмите на различни полимери. Метод продиктувано от необходимостта да се предотврати контакт с филм повърхността на пробата под газ и течни фази. Първо, филм проба се накисват в дестилирана вода и след това се прибавя към разтвора на протеин и се инкубира в продължение на 2 часа при 37 ° С и след това се промива с дестилирана вода и се оставя да престои една нощ при температура 50 ° С или се лиофилизира. Едва след такова лечение, пробите се подлагат на инфрачервена спектроскопия ATR. Концентрацията на протеин (мг / см2), адсорбиран върху повърхността на пробата се определя количествено чрез абсорбция на специфична абсорбция лента (при 1640 см-1) амид I, т. е. група характеристика на протеини. Като стандарт се използва при измерването на загасване Характерните ивици от различни проби (например, полидиметилсилоксан и полиетилен, които са съответно при 1410 и 1460 см-1). Spectral контур, получен чрез тази процедура, са представени на фиг. 73.
По този начин е намерено връзка между концентрацията на разтвора на протеин и адсорбцията на последната върху повърхността на полимерния материал. Той е описан от изотерма на адсорбция е показано на фиг. 74. От равновесие може да се определи кривата концентрация протеин, адсорбиран върху повърхността на високо молекулно вещество. Като се започне от получения параметър може да се изчисли дебелината на слоя на адсорбирания протеин адсорбция средна площ на всяка протеинова молекула, и други характеристики. Резултатите от тези изчисления при 37 ° С са представени в таблица. 43.
Lyman и сътр. [29] счита таблични данни в комбинация с параметри, които описват размера и конфигурацията на молекулите на плазмените протеини. Тези параметри са определени в 40-те години Oncley [30] - това са показани в таблица. 44.
Лиман наблюдение може да се свежда до следните основни разпоредби:

1. Адсорбция на протеин на хидрофобен полимер завършва предимно в мономолекулен слой;

1. Адсорбция се провежда не на страничната (страничен) и чрез терминал (края на) групи;

Фиг. 73. Инфрачервеният абсорбционен спектър на албумин (човешка плазма) на адсорбира върху повърхността на филма полиетилен [29] (използвайки ATR).

1. - полиетилен преди контакта;
2. - след контакт с разтвора на протеин.

Фиг. 74. адсорбцията на гама-глобулин на повърхността на полистирол филм (при 37 ° С).

1. от всички показания, конформацията на адсорбирана денатуриране на белтъците не претърпява значителни промени. Всички по-горе могат да бъдат обобщени в смисъл, че в процеса на тромбоза роля на денатуриране на промяната на протеин е много малък.

Таблица 43. Адсорбция на плазмените протеини на повърхността на някои полимерни материали (при 37 ° С)

Таблица 44. размера и конфигурацията на молекули плазмени протеини [30]

От значителен интерес е работата на Lee и Kim, който се използва за ATR метод инфрачервена спектроскопия да се изследва връзката между полимера и протеин адсорбция на скоростта на притока на кръв [31]. Конструираната кривата на албумин адсорбция върху повърхността на сегментния полиуретан (етер съполимер с уретан и карбамид) в различни кинетични условия са показани на Фиг. 75. От тези криви това следва, че по-висока скорост на потока на кръвта, се постига по-трудно състоянието на равновесие на сорбция, с други думи, по-бързо в кръвта, бавно протеин адсорбция върху повърхността на полимер. По този начин, по отношение на протеин адсорбция и тромбогенезата роля на скоростта на кръвния поток е изключително висока.
Всичко това показва, че цялостното качество на научни изследвания в областта на протеин адсорбция медицински полимери IR спектроскопия чрез метод ATR е приемливо. Това се потвърждава от спектрите, демонстрирана в 1976 г. в Симпозиума VI за използването на полимери в медицината [32] - те са показани на фиг. 76. Въпреки това, има редица проблеми и трудности в тази област, които все още трябва да бъдат решени. Следните въпроси се отнасят до тях.

1. Според характерните ивици на полипептидите могат да бъдат идентифицирани чрез тяхната структура (раздел. 45). Въпреки това, резултатите от IR спектроскопия ATR, строго погледнато, не съвпадат, или във всеки случай не е напълно съответства на позицията, и конфигурацията на абсорбционни ивици в спектъра на предаване. В допълнение, е практически невъзможно да се извърши и ясно се разделят амид I лента в детайли, така че е трудно, като се използва метода ATR, диференциране на различните компоненти на протеините с задоволителна степен на резолюция. Накрая, се увеличава, и приложение става невъзможно метод ATR в ниска честота област на спектъра на (например, в областта на амид V) IR дължина на вълната.

1 - един незаети силиконов каучук-2 - poliftorviniliden- 3 - полиетилен 4 - полиметилметакрилат блок съполимер с поливинил atsetatom- 5 - kuprofan- 6 - полиетилен терефталат.

Фиг. 76. IR спектри на някои полимери, характеризиращи протеин на адсорбция
контакта им с кръвта (отстранява метод ATR).

Фиг. 75. Зависимостта албумин адсорбция върху повърхността на сегментния полиуретана на скоростта на притока на кръв [31].
0 - 1 мл / с 2 - 3 мл / C 3-6 мл / c- 4-9 мл / с е 5-12 мл / сек.
Разкъсана криви - преди контакта с кръвта и твърдото вещество - след контакт.
Фиг. 77. IR спектри на найлон 6 проби, взети метод ATR.

А - проба-B, - след контакт с krovyu- Б - след 1 час, B - след 24 часа.
По този начин, за фини структурни изследвания и идентификацията на този метод, когато се използва самостоятелно не е подходящ.

1. В зависимост от плътността и степента на контакт на проба и призма компресия mikrootkloneniya възникне в нивото на изчезване, така количествено определяне на протеини метод ATR е изключително трудно.
2. Абсорбция лента от 3600-2500 cm -1, 1700-1400 см1 и 900-500 cm-1, дължащи се на вода, са наложени на амидните групи в оглед на това, което е необходимо за отстраняване на водата в измерванията. В тази връзка, бе съобщено, че инсталирането на новоразработените Фурие трансформира може да реши този проблем.
3. Експлоатация на отстраняване вода (конвенционален сушене или сушене чрез замразяване) са изпълнени с опасност от разграждане на протеин адсорбирано на.
4. Когато се използва като полимер проба, съдържаща като найлон, амидни групи, IR спектроскопия ATR метод е невъзможно поради смущения характерни абсорбционни ивици (cm. Spectra на фиг. 77).

UV спектроскопия

За количествен анализ на протеини чрез UV спектроскопия следните основни ленти се използват: а) абсорбцията в област 250-313 пМ, с пик на абсорбция при 280 е причинена LMW остатъци на ароматни аминокиселини, например, триптофан, тирозин или fenilalanina-
б) абосорбция при 225-215 пМ дължи
пептидна връзка (-CONH -) -
в) група в наномоларен порядък 194-191, който е посочен като предварително
отстъпване на пептидната връзка.
Nyilas и сътр. [33] въвежда в гама Булина стъкло микропрашинки разтвор, смес от сеферулитни диаметър 12,5-40,5 mm с размер на частиците от порядъка на микрона и по-долу. Освен това е определено в монитора (екстинкция при 278 нм), концентрацията на протеин в горната част на прозрачна течност и да се намали концентрацията на интерполираната адсорбция на протеини. Получени адсорбционната изотерма на която се изчислява, че количеството на у-глобулин се адсорбира върху повърхността на стъклото като мономолекулен слой, измерена чрез количеството от порядъка от 0,12 г / см2, а средната площ на адсорбцията дължи на всеки протеин макромолекула достига 2180 пМ. Очевидно (и това се потвърждава от таблицата. 44), че тази площ по-голяма от тази, която ще бъде заета от най адсорбция терминал (края на верига) или на страничните (страничен верига) групи. За всички помещения, не изключва възможността, че адсорбция структура глобулин смяна. Трябва да се отбележи, че този извод не е напълно съвпадат с изводите, направени въз основа на Лиман IR ATR спектроскопия. Изисква по-нататъшни задълбочени изследвания в тази област, за да отговори на този въпрос еднозначно.