Използването на Раман спектроскопия в биохимични изследвания - лазерни диагностика в биологията и медицината

6.2 Прилагане на Raman спектроскопия
в биохимични изследвания
Изследването на протеини. Класически обекти за използване Raman спектроскопия на биомолекули са протеини и техните компоненти. Освен това, ако първият Raman спектрите на протеините са получени в края на 50-те години чрез лампите, през последните две десетилетия като се използва източник на възбуждане изключително лазери.
Целта на повечето изследвания проведени методи KR е изследване на молекулните структури и изследването на отделни функционални групи, определяне на тяхната биохимична активност [9, 10].
От конвенционален (спонтанно) Raman спектър на протеин може да осигури информация за своите структурни характеристики, като средната конформация първичната полипептидна верига [P. 8]. По-специално, тази информация се съдържа в позиция и контура на лентата 1 и амид-амид-3. В действителност, всяка амидна група в молекулата на протеин има амид интензивно линия 1, чието положение в спектъра зависи от структурата на тази част на молекулата. По-голямата част от амидни групи в състава, например, а-спирална структура преминава приблизително същото влияние от съседните атоми и по този начин има приблизително същата честота линия-амид 1 (1645- 1657 ст-1).
Амидни групи се състои от (3-структурен фрагмент молекули имат малко по-различна честота от тази линия (1665-1672 см-1). Тъй като реалната вторичната структура на протеин молекула комплекс, наблюдавано в Raman спектъра на този протеин лента амид 1 представлява наслагване на отделни линии.
Същото се отнася до групата-амид 3, които се появяват в различни степени линии: 1260-1295 см-1 (слабо), 1230- 1240 см-1 (силен) и 1245 ± 3 cm-1 (широк), свързани съответно ка спирални (5-структурни и неподреден конформации.
Това показва, че чрез анализ на формата и положението на максимално лента профил (например, група разширяване експериментален спектър но отделни структури), е възможно да се получи количествена оценка на съдържанието на отделните видове структури в тест протеин.
Обширна материал натрупаната до момента на създаването на вторичната структура на различни протеини, до голяма степен се основава на изследване на Raman спектрите на полипептиди с известна структура модел [9, стр 8].
Ние показваме възможностите на Raman спектроскопия в изследването на конформацията на протеини и полипептиди във водни разтвори и в твърдо състояние в пример за изучаване на структурата и взаимодействието на С-протеина миозин и [11]. Тези протеини с молекулно тегло от 140 OOO и 460 000, съответно, се изолират от заек скелетните мускули. Scattering възбуден Ar лазер (Ji = 488,0 нм), запис се осъществява с резолюция от 5 см-1.
Фиг. 6.4 показва Raman спектъра на С-протеина миозин и комплекса. За спектър С протеин (фиг. 6.4a) амид характеризира със силна линия-1 (1668 ст-1) и относително добре дефинирана група от амид 3 (1242 cm1). Такова положение и тяхното съотношение показва, че протеин конформации на молекули С са р-случайна намотка структура и в приблизително равни части.
За миозин (фиг. 6.46) се характеризира със слаба разсейване линия в амид-3, докато вобулацията проявява амид една силна линия 1653 см-1. Налице е също така значително по линия 939 cm-1, съответстващи надлъжни вибрации на основната молекула полипептидна верига. Това показва, че по-голямата част от миозиновите молекули е в а-спирална структура и една малка част от тях - в | $ строежи, структура.
При образуването на комплекс миозин - C-протеинови молекули са прикрепени към последния миозин молекулата в няколко точки, по-специално в леката верига и HMM в субфрагмент 2-опашката на молекулата. Такова взаимодействие би било да може да окаже значително въздействие върху двете структури на молекули. Въпреки това, анализ на Raman спектър на комплекс (фиг. 6.4v) показва, че конформационни промени на молекули не се появят във воден разтвор или в твърдо състояние.

Фиг. 6.4. Raman спектрите на - С-протеин (3% разтвор); б - миозин протеин (6% от таблетката), а - миозин комплекс - С протеин (6% от таблетката). Измерванията бяха проведени при същите условия: в присъствието на 0.09 мола на КС1 и 5 * 10&ldquo-3 мола К3РО4
<оН=7,0) [11]
Използвайки методите на RRC, в много случаи, разглежда отделни атомни групи и техните функции в биомолекула. По този начин, резонансната АВТОМОБИЛИ изпълнение се използва за изследване на сложни молекули на Р-каротен, витамин Bi », металопорфирин [12]. От интерес е изследване на взаимодействието на динуклеотид на коензим флавин аденин (FAD) от ензима протеин глюкозооксидаза [13, 14]. Интересна особеност на тези експерименти е, че максималната абсорбционна ивица FAD получава анти-Стоукс дължина на вълната на сигнала, а не помпа радиация дължина на вълната. В случая, когато резонанса е дължината на вълната на помпата, качеството на получените спектри драстично се влошава. В [14] експериментално потвърждава присъствието на водородна връзка FAD - ензим.
Да разгледаме пример по-подробно чрез проучвания ASRS механизъм belka- каталитична активност на ензима а-химотрипсин [15-17]. Активното място на молекулата включва имидазол група Gis57 остатък свързан чрез водородни връзки с остатъци Asp 102 и Ser 195, при което се образува система за пренос на заряд. Способност подробно описание на процеса срещащи се в активния сайт на а-химотрипсин, предполага, че информация за степента на протониране група G е 57: Метод трансфер протон в водородни връзки води до промяна в протонирането на групата имидазол, който следва да бъде отразено в промяна в вибрационно спектър.
Всъщност, спектри АВТОМОБИЛИ позволи съотношението на интензитета на някои линии (например, ред 1164 cm-1) за получаване на информация за съдържанието на този или (протонирани или непротонирана) образуват имидазол. Използването ASRS ви позволява да се регистрирате линия на имидазол не се проявява в спонтанен Раман спектри.
Фиг. 6.5 показва АВТОМОБИЛИ спектрометър верига конструиран специално за изследване на биомолекули, за които използва импулсна лазери с високо и относително ниска средна мощност [4]. В основата на спектрометъра е лазерен YAG: Nd, работещи в акустично-оптичен Q-прекъсвачи и режим заключена. радиация изход е влаковете на импулси следните честота от 5 кХц. Продължителността на индивидуална импулс в влак на 80-85 к.с., пулс мощност от 0,7 MW. Радиационна осцилатор (1060 пМ) след удвояване на честота кристали LiIOs използва "сигнал" канал и синхронен канал на багрилен лазер помпа. Непрекъснато настройка на активния елемент дължината на вълната на този лазер е в обхвата от 0,56-0,60 mm, което съответства на честотния диапазон разлика VX-v2 = 950-2100 cm-1. генериране на ширината на линията на 0.5 cm-1, 50-60 к.с. времетраене на импулса, пулс мощност от 20 кВт. За да се намали средната излъчена мощност на втория хармонична (530 нм) попада върху пробата се освобождава от единичен импулс влака. В "сигнал" канал лъчение има средна мощност 30-40 MW, пулс - 15 кВт, импулса на 50-60 PS.

Фиг. 6.5. Блок-схема спектрометър АВТОМОБИЛИ [4]: ​​1 - YAG: Nd лазер, 2 - кристали LiI03, 3 - камера "ахат" 4 - огледала, 5 - матрични лазерни 6 - схема за разпределяне на единичен импулс 7 - Fresnel ромб, 8 - закъснителна линия 9 - двуцветни огледала, 10 - кювета, 11 - леща, 12 - отвор 13 - Глан призма 14, - намеса филтър, 15-двойна монохроматор 16 - Пл 17 - многоканален анализатор, 18 - КАМАК модули 19 - плотер, 20 - компютър
Вторият хармонична на VX и v2 багрилен лазер се фокусира от обектив на клетъчна проба. Генерираният анти-Stokes сигнал е насочен и се фокусира от лещи върху вход процепа на монохроматор. За да потискат nonresonant фон линейна поляризация на помпа радиация VX и v2 на се отглеждат при използване на Fresnel ромб. Чрез завъртане на анализатора (Глан призма) до положение на максимално потискане на nonresonant сигнал постигне значителна модификация на спектъра. Това дава възможност за контрол на формата на спектъра поради промени в условията на смущения на резонансната сигнал и nonresonant компоненти.
АВТОМОБИЛИ сигнал, спектрално филтрува с разсеяна светлина с помощта на двойно монохроматор пада върху FZU оперира в режим на фотон броене. Информацията се съхранява в анализатор на многоканален. Регистрация, обработка на сигнали и боя трансформация лазер, произведени с помощта на микро-компютри.
Чрез амплитуда поляризация nonresonant фон потискане чрез използването на този апарат може, по-специално, установи хидрофобна среда на имидазоловия пръстен в междината между subglobules-himogripsina молекула и където намира неговия активен сайт. Фиг. 6.6 показва спектъра на амплитуда и поляризация ASRS-химотрипсин в диапазона от 960 1060 cm-1.

Фиг. 6.6. АВТОМОБИЛИ спектър на воден разтвор на а-химотрипсин при различни ъгли между поляризация оста на анализатора и поляризация вектор от nonresonant сигнала <р: — 1,0° (а), 1,5° (б),
0 ° (в) [4]
В рамките на този диапазон лъжа честота на трептене характеристика на амино киселинни остатъци фенилаланин (1004 cm-1), триптофан (1014 см-1), както и на разтягане вибрациите на C-N (1033 см-1). Интересното е, че всички шест фенилаланин остатъци, които изграждат протеин, открит в непосредствена близост до активния център.
Всички спектри са получени при условия odinakozyh и се различават един от друг чрез ъгълът между оста поляризация на анализатора и поляризация вектор от nonresonant сигнал (<р). Помимо подавления нерезонансного фона поляризационная методика позволяет управлять формой спектра, выделяя или ослабляя в нем те или иные линии. В частности, в эксперименте выявлена линия 1010 см-1, которая совсем не проявляется в спектрах спонтанного КР. Вопрос о соответствии этой линии определенным элементам вторичной структуры белка является предметом будущего исследования.
Уникална възможност да се изследва състоянието на отделните атомни групи, разположени на макромолекулите на повърхността, също дава SERS спектроскопия 17, 18, 19]. За голям брой протеини и аминокиселини, съставляващи последните няколко години, с помощта на този метод се изследва. По-специално, за водоразтворими протеини е показано [19], че печалбата Raman се наблюдава само за групи от атоми, които са на повърхността на протеин глобули и взаимодействат с метала. В същото време линия 1 и амид-амид-3 спектри SERS не се засича. Очевидно, това се дължи на скрининг ефект на пептидни групи странични вериги на аминокиселинни остатъци, които ги отделя от повърхността на метала и възпрепятства ефективно амплификация на съответните вибрациите.
Характеристики SERS когато изучаване протеини показват пример на фоточувствителния мембранен протеин - бактериален родопсин (BR). Молекули на този трансмембранен протеин, се извършва прехвърляне на протонната. За да се разбере молекулярен механизъм на функциониране на BR е необходимо да се определи топография хромофорно център (позицията на ретината остатък). метод SERS спектроскопия се използва за определяне на ретината местоположение спрямо повърхността на мембраната [20].
В адсорбция на сребро хидрозол лилаво мембрана, съдържаща BR може да взаимодейства със сребро като външната и вътрешната страна (фиг. 6.7). Наличието на ивици в спектъра на изхода на хромофор колебание потвърждава сближаване на ретината повърхността на мембраната. Имайте предвид, че сходството на SERS спектрите и RRS в 1000-1400 cm-1 показва, че протеин адсорбция полиен верига транс ретината напълно запазва характеристика на BR във водната суспензия.
Изследването на нуклеинови киселини. Произход Raman спектър на ДНК се получава в 1968 Г. [21]. От тази гледна точка ние проведохме много изследвания с Raman спектроскопия на свободните бази и нуклеотидите, техните комплекси с протеини [22], тежки метали и други елементи и съединения. Получават Raman спектрите на природните вирусни разтвори [23] и хромозоми [24].

Фиг. 6.7. RRC спектри водна суспензия пурпурен мембрани различна концентрация: А - 10_6 в - 10-7 мол / л, б - SERS спектър пурпурен мембрани адсорбирани върху сребро хидрозол, концентрацията на 10-7 мола / п- в по-ниския диапазон на чувствителност се увеличава в два пъти [20]
Възможностите на Raman спектроскопия за изследване различни характеристики на нуклеинови киселини може да се докаже чрез експеримент ДНК топене [25]. Фиг. 6.8 показва получените температури в различни Raman спектрите на ДНК, изолирана от телешки тимус. Тъй като температурата на ДНК топене в интервала от 80 до 85 ° С, след това Raman спектрите може да се види, което се случва с молекулите по време на топене.
Изследването на температурната зависимост на Raman спектрите помазва че температурния профил на интензитетите

Фиг. 6.8. Raman спектрите на воден разтвор на ДНК, изолирана от телешки тимус при температура 98 (а), 84 (б) и 25 ° С (в) - рН = 7.0 [25)
и честоти различни междумолекулни връзки могат да бъдат отнесени към различни категории: 1) за свързване бази което съответства обратими намаляване интензитети на линиите, точката на топене горе, т.е. определен феномен predplavleniya- 2) свързващи основи, за които температурната зависимост е слаб или липсващ .. - 3) dezoksiribozofosfatnye комуникация гръбнак за kodebany характеризира с липсата на температурната зависимост под точката на топене и силна ikuensivnosti спад в този момент.
Някои линии, съответстващи на четирите бази (Alenin (A) - тимин (Т), цитозин (С) и гуанин (G)), се подлагат на постепенно повишаване на интензивността с повишаване на температурата под точката на топене. При достигане на тази точка има рязко увеличение на интензивността на тези линии (например, линия T 1240 см-1 на фиг. 6.8). Това предполага, че някои промени в подреждането на база по отношение един на друг (вертикално подреждане) започват да се случи, тъй като температурата на 50 ° С, напр. Значително под точката на топене. При достигане на точката на топене на ДНК молекули променят своята конформация, като се започне от D-форма, за да образуват произволно нарушено намотка.
Висока чувствителност чрез откриване фините конформационни промени в ДНК става SERS спектроскопия. По-специално, записани фините ефекти на дестабилизиране на двойната спирала на ДНК, в резултат от действието на дори ниски дози йонизиращо лъчение [27] и мутагенни фактори [28].