Лазерна спектроскопия Доплер на живите клетки - лазерни диагностика в биологията и медицината

Лазерна спектроскопия Доплер на живите клетки и диагностика на вътреклетъчния мобилност

Обща информация. Към днешна дата, много изследвания направено, за да се разработят методи и практически регистрация подвижността на живите клетки в суспензия: бактерии, животински и човешки сперматозоиди, водорасли и др (виж например [50-54]) ... Тази мобилност не е характер термична дифузия, случайни разходки и елементи с праволинейни, въртене и спираловидна движение. Всяка от тези движения допринася за спектрите на Доплер разширяване. Ето защо, точно описание на леки резултати на разсейване в комплекс мулти-параметър математически модел. Въпреки това, разработени процедури могат да бъдат получени от експериментално измерени разпределение на скоростта на спектрите, относителният брой на мобилни и фиксирани клетки и редица други параметри.
Като се има предвид, че предметът публикувани голям брой обзорни статии (виж., Например, [53, 54]), ние няма да го обсъдим по-подробно и да пристъпи към обсъждане на проучвания вътреклетъчен мобилност, в които използването на лазерна Доплер спектроскопия (СПД) е много обещаващо [55, 56].
Първото използване на този метод за решаване на проблемите с регистрацията, насочени вътреклетъчен мобилност в големи растителните клетки се отнася до 1974 [57]. ясно Доплер спектри характеризиране на разпределението на постоянни скорости са получени чрез светоразсейване частици, съставляващи протоплазмата на тези клетки (ядра, митохондрии, и т.н.). В следващата поредица от статии [58-64] демонстрира високата ефективност на светиите от последните дни като редовен метод за решаване на проблеми от Биофизика мобилност, което позволява да се извърши регистрацията на нестационарни клетъчни реакции към външни дразнители, което е важно за изучаването на механизмите на пространствената и времевата организация на клетъчната подвижност и нейното регулиране, и така нататък.
Отличителна черта на лазер наблюдение на единични живи клетки все още е фактът, че светлината се разпространява не само се движат вътреклетъчните органели, но и фиксиран на клетъчните стени. В първия случай, разсеяна светлина се появява доплер честота смени, докато разсеяна светлина през втората честотата не се променя.

Вторият компонент е неизбежно разсеяна светлина пада на фотодетектора, което позволява да се използва този компонент като референтен радиация за прехвърляне честота доплер измества към по-ниски честоти от heterodyning. По този начин, наблюдение верига с един лъч може по принцип да предостави режим на измерване хетеродинни Скоростите вътреклетъчни частици. Разбира се, условията трябва да бъдат изпълнени ефективно и хетеродинния OS, които в някои случаи се извършва автоматично, а в някои допълнителни усилия.

Фиг. 3.11 блокова схема на измерване и изчислителна система въз основа на единични светлини LDS
Монтаж Описание. Фиг. 3.11 е диаграма на измерване и изчисляване система, създадена за изследване на вътреклетъчния подвижността [65]. Не-Ne излъчване на LH-38 тип лазер (/), отслабена чрез набор от филтри (2), се фокусира от обектив (5) на клетката (4), фиксирани в кюветата (5) в специалните притежателите (6). Разсеяна светлина преминава през системата от лещи и диафрагмите (7) на PMT (8), работещи в текущия режим. Сигналът след амплификация и филтриране в усилвател LF (9), снабдена паралелно осцилоскоп (10) за визуален контрол на реално време спектрален анализатор SK4-72 тип (11), като освен индикатор електронно-лъчева цифров изход и аналогово-цифров преобразувател (ADC) (12), който преобразува аналоговия сигнал в отделни проби с честота, определена от софтуер и продължителност. Тези проби се подават към компютър (13) за спектрален преработка, която се изпълнява по време на или след регистрирането на пробата в паметта.
Всички са получени следните резултати от обработка на сигнали за ЕС-1010 компютъра, въпреки че вместо да се използва във всяка друга машина от същия клас. На една и съща машина може да бъде снабден с дигитализирани анализатор изход спектър и изходните сигнали от други сензори (например, температура габарити, мембранния потенциал, или други подобни.) (14). Компютри, оборудвани с външни устройства: буквено-цифрови (15), както и графика (16) дисплей, плотер (17), както и печат (18). Част от комплекса е софтуерен пакет за събиране и обработка на данни, както и за контрол на експеримента.
Основните характеристики на комплекса, се определя до голяма степен от спецификата на задачата и имоти-
на обектите, може да се нарече: времето на получаване на средно Доплер спектри с задоволително

Фиг. 3.12. Спектърът на Доплер получен от жива клетка charophytes с неподвижно над protoplazmy- 0 = 45 °, Т = 10, Т = 20 ° С
точност (обикновено в рамките на 10%), m = 1-6 С- измерване на скорости над насочено движение к = 10 -1000 микрона / в хардуер разширяване на спектъра на A / а = 0.5 Hz - 2 м измерване L = 100 -500 mkm- възможно брой измервания канали доплер п = 4 (в допълнение, може да се въведе в компютъра по-бавно променя сигнали от други сензори), - плътността на излъчване на енергия в региона сондиран клетки W = L-100 W / cm3. Точната стойност на експозицията на прага nondemolition е настроен за всеки тип клетки преди експеримента се отчитат измервания на дължина, коефициент на поглъщане, както и редица други фактори.

Резултатите от измерването. Фиг. 3.12 полулогаритмичната мащаб е показано в характерен вид спектър Доплер получен в измерването на големи клетки charophytes Nitella, не са подложени на външни влияния. Формата на спектъра се определя главно от разпределението на скоростта на обема на измерване, и показва, че по-голямата част от частиците се движат със скорост т>= 40 м / сек, съответстваща на максималната честота в спектъра. В нивото на стационарно състояние поток от протоплазма в тези клетки са малки колебания, така че средната спектър може да се извърши за дълго време (няколко минути), което ще се намали разпространението на спектрални компоненти. Въпреки това, тези измервания са чисто методологичен интерес, тъй като оценка стационарната скорост може да се направи чрез визуално наблюдение чрез оптичен микроскоп.
Значително по-голям интерес от гледна точка на горните проблеми е биофизични преходни наблюдение quasistationarity с характерен време на най-малко 1 сек. Въпреки това, той трябва да се задоволи с по-значителни стойности на сигнала плътност разпространение мощност спектрални, което води до големи грешки в измерването.
В живи клетки Nitella движения преходно вътреклетъчни се провеждат при външни влияния :. светлина, механични, електрически, химически и т.н. Например, електрическа стимулация чрез прилагане на електрически импулс на напрежение NS = 100 MV, продължителност Ti = 1 с външната възбудима мембраната води до акционния потенциал поколение и последващо спиране протоплазма поток бързо с по-нататъшното му намаляване [64]. Съответстващо на процеса промяна на формата на спектъра на Доплер е показано на фиг. 3.13.
Когато движението ограничител (фиг. 3.13a) на Доплер спектрални компоненти изчезват и остава само разширени линия, което отразява присъствието на дифузия и други не-насочено движение в клетката. С течение на времето, като токът на възстановяване се намалява и протоплазма доплер спектрални компоненти (Фиг 3,136 -. R). В зависимост от външните параметри влияе на времето за достигане на първоначалната стойност на дебита може да е 5-10 минути или повече, а в някои случаи могат да се установят дългосрочни процеси, като колебателно характер.

Фиг. 3.14. Три примера на процеса на възстановяване насочени потока в протоплазмата клетка след бързо спиране (стоп точка показана със стрелка)

Фиг. 3.13. Кинетика Доплер възстановяване спектрална форма след временно спиране на притока на протоплазма
Различни кинетика на възстановяване, насочен вътреклетъчен мобилност са показани на Фигура 3.14.
Трябва да се отбележи, че колебанията наблюдавани проценти не са проява на патологичното състояние на клетката. Периодите на трептене постоянни за всеки конкретен клетки вземат стойностите са в границите от 5 до 10 минути и вибрации форма може да бъде quasiharmonic и в близост до релаксация. Интересното е, че колебанията на скоростта са придружени от колебания в потенциала на мембраната, но те се различават в периоди на два пъти [64]. скорост на знаци на възстановяване зависи от условията на осветеност в периода преди стимулация.
Правени са опити да се освободи обща фоновия сигнал само разсеяна светлина от определените частици играят важна роля в механизма на създаване на движеща сила. В частност, такива частици в съответствие с някои хипотези са sferosomy - сферични частици, съдържащи миозин и с диаметър от 0.2- 0.8 микрона. Предполага се, че частиците осцилира в равнина, перпендикулярна на основната посока на потока на протоплазма. Такива техните движения трябва да доведат до сигнал в спектъра на равноотстоящи пикове LDR ширина пропорционално на времето на отчитане на всеки спектър. Разстоянието между тях в честотните ос, в съответствие с изчисляването на трябва да бъде равна на средната честота на трептения на частиците. За да се настройва от силно доплер сигнал, свързана с насоченото движение по протоплазма клетка, измерванията се провеждат така, че разсейване вектор Q е ориентирана ортогонално към главния поток. Така, в допълнение към спектъра на желаните компоненти сигнал допринесе ортогонални компоненти на скоростта в резултат евентуално в сблъсквания движещи се частици, както и компонентите на дифузионно движение.
Фиг. 3.15 показва Доплер спектър, получен в тази схема в същия експеримент и измерване на същия обем като спектъра, показан на фиг. 3.12. Спектърът е числено използва алгоритъм • бърза трансформация на Фурие по отношение на отделни проби на сигнала, предавани напреднал цифрово филтриране за отстраняване на по-високите честотни компоненти, които биха могли да нарушат желаните компоненти поради честота заглаждане. Резолюцията на честота 0.1 Hz, докато получаване един от спектъра - 55, която не надвишава почти неподвижно движението на частици в клетката.
След обработка и памет 90 построена спектрални стойности хистограма честотни съответстващи добре различими максимуми. Статистическият анализ на резултатите проведени по метода на изпитване хипотеза показа, че максимуми регистрирани статистически значима, където открива прекъсване в спектъра с средното разстояние между хармоници на 3.6 ± 0.6 Hz съответства на теоретичното изчисление.

Фиг. 3.15. Спектърът на Доплер, получен по време на регистрацията на разсеяна светлина в равнина, перпендикулярна на основната посока на потока на протоплазма
В същото време, за резултатите, получени до този момент не следва своята ясна връзка с вибрационен spherosome движение. За такава връзка ще трябва да се изолира разсейването на светлината само sferosomami, че не е възможно, или да изключи други периодични движения на структурите разсейване. Изследванията в тази посока са в ход.
Въз основа на обширни експериментални данни, получени с използване LDS, редица модели изградени задвижващ механизъм сила поколение, в резултат на движение на протоплазма charophytes [66].
Друг пример на приложение за изследване на нестационарни LDR вътреклетъчен мобилност отнася до движението на регистрация протоплазма лигава гъбички Physarum polycephalum [56, 59, 61, 67-70]. Тази задача е значително различна от тази счита горе в морфология, природата на мобилност и оптични свойства. В tyazhah представлява тънък (100-500 микрона) и дълго (1-2 cm) тръба поради периодично контрактилната активност стена възниква по време на променлив протоплазма с quasiperiod Tv = 1-2 стр.
Фиг. 3.16 показва три спектри, получени от нишки с различна скорост на потока протоплазма. Спектър 1 се получава приори- минимален обхват скорост на потока от 3 - при максимална. Интересно е значителна разлика между спектрите характеристика на обекта, от спектрите записани от клетките на водораслите. Както се вижда от изчисления и измервания на модел капиляри [71], формата на спектрите не е определено само профила скорост на обема на измерване, но също статистически параметри на оптично разсейващо светлина нехомогенности стена ограничаващи потока. По отношение на този обект втората от тези фактори има доминиращо влияние.

F, кХц
Фиг. 3.16. Три Доплер спектър, получен от Plasmodium miksomitsetov и съответстващи на различни скорости на потока протоплазма: "(/)<» (2)Разбираемо е, че съгласно такъв диапазон, че е възможно да се каже не на първичен или най-вероятната скорост протоплазма, но определена ефективна скорост CEF или средна скорост на потока се определя чрез превръщане от формула (3.3) на половината ширина на спектъра на определена височина.

Фиг. 3.17. Зависимостта на времето на ширината на спектъра на Доплер, получен от Plasmodium слузести форми с совалката над протоплазмата
Независимо от това, промяната на времето този параметър отразява кинетиката на вътреклетъчния транспорт протоплазма.
Фиг. 3.17 показва типична време зависимост от функционален модул IEF на (I), записани на един лъч
спектрометър. Всяка точка от кривата съответства на половината ширина на спектъра, получен чрез осредняване над 64 "моментните" спектри с общо време за измерване на 5 секунди.
Имайте предвид, че подобни криви получени от LDS, както качествено и количествено в съответствие с тези, получени чрез визуалната измерването, филм чрез оптичен микроскоп, но се различават по-висока резолюция и не съдържа елемент на субективността. Важно е също така, че обработката и представянето на данните се извършва в реално време и в края на кривите на експеримента, се съхраняват в паметта на компютъра като масив от числа, готови за последващо по-нататъшна обработка.
Анализ на тези криви, получени с различни експериментални условия, включително тези, които произтичат от много точки наблюдение на многоканален спектрометър изпълнение [8, 56], се получава най-много информация, която се използва за конструиране на модели на вътреклетъчния подвижността [66, 68, 72, 731. По-специално изследва влиянието на температурата квази-стационарни и импулсивни въздействия промяна трептения проценти период Tv поток са показани възможни за синхронизиране на тези трептения външната дейност [2, 69], данните на възможно вид на фактор, вътреклетъчни синхронизиращи осцилатори (определящи елементи ритъм) [8, 67] показва присъствието на активни контрактилната работни направления, в резултат на движение на протоплазма, [68], и така нататък. г.
Лазерно Доплер микроскопия. В горните примери се използват за измерване на спектрометъра осигурява местно проба от около 100 мм, което е достатъчно, поради относително голям размер на изследваните обекти. Когато се работи с малки клетки се нуждаят от по-висока разделителна способност - от порядъка на няколко микрометра. Това се постига така наречената лазерна Доплер микроскоп (LDM) чрез използването на късо оптика и специална геометрия подреждане на елементи [74-84]. В повечето случаи, LDM се извършва въз основа на серийни оптически микроскопи, което ги прави компактен, лесен за настройка.
Фиг. 3.18 е блок-схема LDM извършва въз основа на микроскоп "LUMAM" (1), конюгиран с микро компютъра (2) и е предвидено за удобство на настройките на TV камера (3) и телевизионен монитор (4) [84]. Микроскоп строителство възможно да се реализира както разлика и един клон верига (чрез припокриване една от гредите) от таблични пробни греди към обект отдолу или (/) или горната част (//). В първия случай фотодетектора (5) открива разсейването на светлината напред, във втория - преди.

Фиг. 3.18. Блокова схема на микроскоп лазерен доплер
Обемът на измерване се формира от фокусиране (б) и (8), разположени на приемника (7) и отвор лещата пред фотодетектора в равнината на изображението. По този начин, чрез увеличаване на лещите 15 х 30 и X, и размера на отвор 150 микрона надлъжен размер на обема на измерване на ALJ = 7,5 mm, и напречна AL2 = 2,5 м. Коефициентът на мащабиране, свързани измерената скорост от честотата на Доплер изместване е 1.3 микрона / (S * Hz).
Преди да потегля с акцент обектива двете греди минават през контролиран акустично-оптични модулатори (9)
при което те придобиват относителната честота преминаването на L /, която може да се регулира в диапазона 102-105 Hz. Наличието на честота разлика у на опипващите греди прави LDM чувствителни към посоката на потока на теста и позволява uninformative възстановен от нискочестотни компоненти на сигнала Доплер [14].
обработка Схема след фототока усилвател (12) включва тип реално време анализатор S4-72 (13) и / или компютъра (2), снабден с дисплей (15) задвижва с гъвкави магнитни дискове (16) и плотер (17). Сигналът се подава към компютъра, след вземане на проби чрез интерфейс единици (14), предвидени в стандартната KAMAK- микроскоп и е снабден с видеорекордер (18) за запис на телевизионни изображения на обекта.
LDM описано е предназначена предимно за научни изследвания, насочени движения в клетките, но има по-широк обхват на приложения.
С помощта на лазерна Доплер микроскоп, получени от различни уникални резултати. По-специално, насочено движение на частици регистриран в единични соматични клетки [82] А пряко наблюдение на натрупване на В-кристалин в ембриона на обектива мадама [83]. На фона на интензивни клетки протоплазма водорасли поток открити анизотропия на транслацията дифузионен коефициент на частиците в различни посоки в клетката [80, 81].
Тези и много други резултати показват, че СПД и LDM се е превърнало в ефективен инструмент, който може да отговори на широка гама от клетъчни проблеми биофизика.