Физическа база на Раман спектроскопия - лазерни диагностика в биологията и медицината

Лазерно Раман спектроскопия
разсейване
Тази глава се занимава с методи, базирани на mikrodiagnostiki нееластичен (Raman) разсейване (Raman) светлина от биологични молекули. Тъй като биологични обекти, в повечето случаи, са изследвани във водни разтвори или съдържат голямо количество вода, техники спектроскопия Раман имат важни предимства в сравнение с други методи mikrodiagnostiki чието искане за изследване на биомолекули в природната среда е трудно поради абсорбция на вода.
Към днешна дата, голяма натрупани експериментални данни за Raman спектроскопия на биологични молекули, особено протеини и нуклеинови киселини. Някои примери за тези изследвания са представени в тази глава.
Освен това биомолекули и техните комплекси обекти Raman спектроскопия все живите клетки и многоклетъчен структура. Големите перспективи се откриват във връзка с развитието на технологиите Раман микроскопия.
Освен методи спонтанен Раман спектроскопия, са дадени основни сведения за сравнително нови и най-обещаващите техники: Раман разсейване спектроскопия и Раман спектроскопия активен.
Физическа база на Раман спектроскопия и неговите разновидности
Спонтанно Раман разсейване. Един резултат от взаимодействието на светлината с биологични обекти е нееластично разсейване, която варира поради не само посоката но и честотата на излъчването. Фиг. 6.1 показва възможни изпълнения и ефекти на взаимодействието на светлината с квантовата молекулата. тук, на

и първото електронно възбудено състояние обозначени S0 и съответно. Всяка от тези енергийни нива съдържа множество вибрационни поднива Y 2, 3 ,. D. Преходите между различните нива и поднива обозначени със стрелки, при което дължината на стрелката нагоре, пропорционална на честотата на падащата светлина.

Фиг. 6.1. Възможни енергийни преходи в молекулата, нееластичен фотон взаимодействащи със светлина
Дължините на стрелки, насочени надолу пропорционално на честотата на разсеяна светлина.
В резултат на взаимодействието в за време на периода на леки колебания, т. Е. приблизително 10 -15 секунди, молекулата се премества до по-високо енергийно състояние. След това при интервал от време от около 10&rdquo-11 освобождаване може да се случи с квант светлина, но е с честота, която е с честота на комбинация от падащата светлина и вибрационна честота преход. Освен това, ако освободен фотона е с честота по-ниска от честотата на падащата светлина, а именно v0 - vK0J1 (стрелка завършва в вибрационно ниво, разположен над източника), се наблюдава, така наречените Stokes Raman разсейване на светлина компоненти. Ако има енергиен преход към състояние под началното ниво, т.е.. Е. Енергията, освободена инцидент фотон повече енергия (v0 + vKOJI), след като компонент се нарича анти-Stokes Raman. И в двата случая, разликата в честотата между инцидента и разсеяна светлина V0- (v0 ± vKOJI) е равна на честотата на молекулно вибрации.
Вероятността за спонтанното Раман значително по-малко, отколкото вероятността от Rayleigh (еластична) разсейване, като по този начин много нисък интензитет на сигнала. По този начин при нормални условия на интензивността на анти-Stokes разсеяна светлина компонент е значително по-малък от интензивността на компонента Stokes. Интензитетът на сигнала зависи от честотата на падащата светлина: далеч от областта на електронната абсорбция е пропорционална VJ, когато наближава абсорбционния спектър се наблюдава по-бързо увеличаване Раман интензивност. След контакт с честота v0 в областта на абсорбционни ивици на веществото има т.нар резонанс Raman разсейване (RRS).
Интензитетът на RRS линии може да бъде няколко порядъка по-голяма от силата на конвенционален CD. Поради това, при използване на RRC може селективно откриване на светлината, разсеяна от отделните съединения в многокомпонентни биологични системи. Конвенционални интензивност Раман от другите компоненти на системата по този начин толкова малка, че на практика не се различава от фона.

Тъй като всеки биомолекула се състои от голям брой атоми и атомни групи, интензитета на падащата светлина,
Фиг. 6.2. Raman спектър на течна вода, произведена при възбуждане на Аг лазер (= 488 нм, Н-1 = 20,492 см&rdquo-1). На абсцисата е абсолютните и относителни единици (брой вълна)
взаимодейства едновременно с много атома, като Раманов спектър, линии. Позицията на линиите в спектъра се определя само от основните честоти на трептене електронните състояния (стойности vK0JI й). Ето защо, Раман спектроскопия - тази опция вибрационна спектроскопия. По същия начин, IR спектроскопия, Раманова спектроскопия смисъл използване при изследване на биологични обекти е изравнителен Raman спектрите на химичните свойства на тези обекти, съставляващи биомолекули и техните непосредствена близост, е добре характеризира с вибрационното спектри.
Фиг. 6.2 е показан един прост пример на Raman спектър на течна вода - естествени физиологични разтворители биологични съединения. Спектърът се получава чрез възбуждане на лъчение с вода Ar лазер (А = 488 нм). Хоризонталната ос представлява дължина на вълната в нанометри, съответстващ брой вълна, както и промени в сравнение с броя на вълната на широка излъчване (А, -1 = 20,492 см-1). Най-силната линия в спектъра <3415 см-1) появляется в результате обмена энергии падающего света с энергией валентных колебательных движений, соответствующих растяжению связи О—Н. Колебания,, происходящие при деформации угла Н—О—Н в молекуле воды, проявляются в КР-спектре существенно слабее (линия 1619 см-1).
Важна характеристика на Raman спектъра на вода е, че с изключение на линията на разтягане вибрации интензивността на този спектър е ниска. Това му позволява да се получи ясна линия фон Раман спектри на разтворени вещества. Това Raman спектроскопия е коренно различна от инфрачервена спектроскопия, защото водата значително абсорбира инфрачервено лъчение.
Сравнение на интензитетите на линия в Raman спектри, получени от голям брой различни молекули направи възможно да се формулират някои общи правила [1, P. 8]. Например, простираща вибрации са показани в Раман спектри силна деформация вибрации (видяхме в този пример, вода) - линия множествени връзки колебания трябва да бъдат по-силни от линия колебания прости svyazey- линии поради вариации в фаза валентните връзки, по-интензивни, от линиите, които трябва да се анти-фазови трептения на тези връзки.
Обикновено, Raman спектрите на многоатомни молекули преобладаващ принос някои отклонение групи от атоми. Те са често срещани в органични молекули групи като С-Н, О-Н, N-H, S-H, С = С, С = 0, и др. Точното положение на спектрите на линии, съответстващи на тази група колебания зависи от вида на връзки с други атоми. Така, в спектрите на молекули с група = С-Н, има линия от 3300 cm-1 групалиния съответства на 2960 см-1 и gruppeliniya 3020 cm-1.
Пример за по-сложна група от атоми, действат като независим осцилатор в молекулите на полипептиди и протеини е т.нар амид

амино киселина, образувана при свързване към друг, различни видове трептения на тази група са показани в Raman спектрите като така наречените амидни ленти 1, 2-амид, амид-8. Най-силната група амид-амид и 1-3 близо до номер на вълна съответно 1660 см-1 и 1250 см-1,. амид-2 лента в Raman спектрите на протеините е слаб. Точната позиция на максимуми на лентите и техните форма контурите дефинирани протеин вторична структура.
По подобен начин, вибрациите на фосфатни групи

гръбнака на ДНК и РНК молекули са отговорни за появата на CD-спектрите на тези две макромолекули силни характерни линии до 800 и 1100 см-1. Интензитетът и позицията на първата от тях зависи от структурата на вторична структура и ред.
Характерните линии са налични в спектрите Раман, и други биологични макромолекули. В допълнение към тези характерни линии на Raman спектрите на биологични макромолекули и системи съдържат голям брой други линии, които послепис някои вътрешномолекулни вибрации представлява една от целите на Raman спектроскопия на биологични обекти.

Фиг. 6.3. Блокова схема на устройството за записване на Raman спектри в един типичен експеримент: 1 - Laser 2 - насочени леща, 3 - клетки с тестовата проба, 4 - хладник 5 - вход прорез 6 - монохроматор 7 - фотоумножител или многоканален анализатор

Обща информация за експериментални техники. Фиг. 6.3 представя основните оптични елементи, необходими за регистрация на спонтанно Raman спектрите на типичен експеримент. С помощта на лазер като източник на интензивна монохромни радиация в експерименти на възбуждане и записването на компакт диска е необходимо условие за бързото развитие на този метод и неговото прилагане в широк химия и биология.

Лазери са отстранени по-голямата част от предварително привидно непреодолими проблеми и ограничения, свързани с местата на изпитване и, както е споменато по-горе, техните водни разтвори. Най-често използваните непрекъснати Аг и Кр лазери дискретни регулиране на дължината на вълната, както и боядисване на лазери и параметрични осцилатори светлина непрекъснато настройваем дължина на вълната. Импулсните лазери позволяват poluchat` висок импулс на сонда радиация мощност при относително ниска средна мощност и най-важното, високата временната резолюция на записаната спектри.
Регистрация Raman спектър се извършва или чрез фотоумножител свързан с сканиране монохроматор (обикновено се удвои за надежден разстройване от еластично разсеяна светлина) или оптична многоканална анализатор. Този анализатор е линия от няколко стотици миниатюрни фото детектори с висока чувствителност или телевизионна камера. спектрометър спектър сканираща линия записват последователно с целия спектър от порядъка на десетки хиляди см с резолюция до няколко обратни сантиметра се получава по време на няколко секунди.
С помощта на оптичен многоканален анализатор ви позволява да влезете всички линии на спектъра в същото време, което отнема значително по-малко време, за да vplot- нано- и пикосекунди.
Една от пречките в регистрацията Раман спектри изпълнява луминосценция проби фон - процес по-склонни от компакт диска (виж глава 7 ..). луминисцентни източници са примеси или ендогенни хромофори. Намаляване нежелателно фон луминисценция припокриване понякога слаб Raman линия, да се постигне цялостно почистване на пробата, изборът на оптимална възбуждаща дължина на вълната радиация или прибавяне на разтвор на изпитваното вещество специално гасители на. В някои случаи е възможно изгаряне луминисцентни примеси от продължително излагане на пробата от интензивна лазерна радиация. Последният метод, обаче, може да доведе до фотохимично модификация и дори разрушаване на пробата.
Повече обещаващ чрез отделяне на Raman спектрите на луминисценцията е използването на Раман лазер за възбуждане на пикосекундни импулси. От времето на живот на дори бързо луминесценция (флуоресценция) се намират в границите на наносекунда (вж. Гл. 7), за разлика от порядъка пикосекундни от компактдиска, с помощта на система за регистрация високоскоростна изключва след получаване на Раман радиация преди да се присъедини лъч луминесценция, може да елиминира на заден план линия на спектъра.
Active Раман спектроскопия (CARS). Фундаментално различен метод на регистрация Raman спектрите на обекти с високо ниво на флуоресценция е АВТОМОБИЛИ [2]. За да се приложи този метод се използват две настройваем лазер с честота Vj и v2 радиация. Пресечната в проба, радиационните лъчи на лазерите него индуцират диполен момент, характеризиращ се с нелинейна податливостта на третия ред. Резултатът е съгласуван анти-Stokes разсейване с честота VA = 2vx-v2. Посоката на разпространение на сигнала се определя чрез извършване фаза съвпадение на вълната вектори на взаимодействащите вълни различава от посоката на разпространение на излъчване на помпата. Интензитетът на тази разсеяна светлина увеличава значително, ако разликата честота VX-v2 съвпада с честотата на изследваните на вътрешномолекулни вибрациите. Различни VX-срещу чрез настройка на честотата лазер може да предпише Raman спектри в широк диапазон и по този начин ефективно изграждане на флуоресценция в кратък региона анти-Stokes.
Друго предимство е възможността да се позволи ARS близко разположени и припокриващи спектрални линии, свързани с факта, че спектрална резолюция не е АВТОМОБИЛИ спектрометър монохроматор се определя, и ширината на линиите на лазери използвани [2].
Получаване качествени АВТОМОБИЛИ спектри предотвратява присъствието на не-резонансната нелинеен оптичен сигнал поради приноса на молекулите на разтворители. Инхибиране на се извършва чрез елементите на поляризация се използват различни характеристики поляризация резонансни и nonresonant вноски [3, 4].
Засилено Раман разсейване (SERS). През последните години, молекулярна биология и биохимия са започнали да използват различен вид вибрационна спектроскопия, въз основа на феномена на леки SERS [5-7]. Същността на това явление се състои в големи (до 105-10e пъти) увеличаване на Раман напречно сечение молекули адсорбирани върху металната повърхност. В резултат на спектрите SERS са били в състояние да се регистрира при концентрации няколко порядъка по-малък, отколкото в конвенционалния Raman спектроскопия.
В SERS явления на базата на два механизма: соленоид свързан с увеличаването на местно електромагнитното поле в близост до повърхността, и молекулното, свързани с образуването на възбудени състояния на металните комплекси от молекули [8]. Интензивно SERS се наблюдава по-често върху специално приготвени металните повърхности със силна грапавост. SERS спектри на биологични молекули са склонни да излезе в електрохимични клетки, в хидрозоли на метали и метални филми с редовни нехомогенности. За регистрация на спектрите се използва същата техника, както при конвенционалните Раман спектри. За да се прилага не възбуждане лазерно лъчение във видимия диапазон, който обикновено надхвърля капацитета на няколко десетки миливата.