Поток Анализатори микрочастици - лазерни диагностика в биологията и медицината

Видео: Khaidukov SV Изследване на лимфоцитна субпопулация състав от периферна кръв

Видео: флоуцитометъра отвътре. Вътре Цитометърът на потока.

Flow анализатори микрочастици
Обща информация. В лабораторни диагностичен практика при работа с биологични течности, съдържащи частици от неорганичен или органичен произход, изследователите обикновено се интересуват предимно от размери концентрация, състав, и на частиците. Тези проблеми обикновено възникват при анализа на кръв, сперма, урина утайки и т.н. За медицински микрочастици анализатор има уникални изисквания, най-важните от които - .. малък обем на пробата, висока концентрация и полидисперсност на размера на частиците анализира. Понастоящем е налице значителен брой инструменти за определяне на концентрацията на микрочастиците в течности [P. 48, 50]. Въпреки това, устройствата са подходящи за употреба в медицинската практика, известно е сравнително малко.
Оптични методи за изследване на биологични течности може да се основава на явлението дифракция, светлина затихване, въз основа на представителния техниката и т.н. По-често, отколкото не се основава на намаляване на светлинните анализатори са изградени, което е съществено достойнство -. А широк диапазон от размери записва, без предварителна обработка на пробата под изследване. За да направи това, реакцията на фотодетектора се определя чрез отчитане на интензитета на разсейване на светлината на микрочастици на базата на ъглите за конвергенция на инцидента и получаване на светлинните лъчи. В зависимост от стойностите на наблюдения 0 ъгъл прилагат различни методи за измерване: за 0 = 0 ° говори за фотометрични методи за изследване, ако ъгълът на наблюдение е в близост до нула, с права светлина не се счита, след това реализира ниско ъгъл или дифракционни методи, при 180 ° имат лидарни техники. За биологични проучвания най-често използвания метод малък ъгъл за откриване на радиация.
Характеристики на анализатор лазер частиците. В СССР разработени и произведени от търговската Vp-1 (микрочастици поток анализатор лазер) инструмент въз основа на метод за определяне на размера на микрочастиците на напред разсеяна светлина интензитет [511. Устройство за определяне на концентрацията на микрочастиците в суспензия, изграждане и анализ на микрочастици с размер разпределение хистограма с помощта на микрокомпютърна.
Функционална схема на устройството, показано на фиг. 2.7, което показва входния буфер течност устройство (BZ), инжектиране на пробата (P), опто-електронен блок (МА) и електронната система за обработка на данни (ЕО). Изследваното лекарство се доставя от P устройството за спринцовка 13 заедно с буфер течността от контейнера 1 BZ устройство в камерата за поток 2 с плоски стъкла ЕО блок. Beam Не-Ne лазер (X = 632,8 нм) 9 се фокусира от обектив 10 на измервателния брояч 11 диаметъра на обем от 100 микрометра, чрез които частици преминават последователно генерират импулси на разсейване на светлината. Директен unscattered радиация се потиска Фуко нож филтър 12. сигнал от фотодетектора 5 се подава към многоканален анализатор импулс височина 7 и в ЕО система електронна обработка на информация микро-компютър 8. Контрол на режима анализ проба с помощта на съединителния блок 6,
сигнал, който контролира моторното задвижване 13 на дозатора 3 с помощта на специална електронна схема 4 Р1 единица. обем на пробата от 20-500 mm3 при скорост на потока на течността буфер 1 см3 / сек.

Фиг. 2.7. Схема анализатор Vp-1 [P. 51]
Много внимание се обръща на дизайн на камерата на потока с хидродинамично фокусиране поток от тест течност и анализ на въздух. прозорци камерни плоски поток предотвратява нежелано пречупване на стъклени тръби, обикновено използвани в такива системи. Най-голямата грешка при определяне на хистограмата разпределения на микрочастици, причинени от неравномерно интензивност на лазерното лъчение, изместването на сонда спрямо потока на пробата поради център тогата че частиците приплъзване през различни области на обема на измерване са в различни условия на осветяване. Обхватът на определен размер на частиците от 0,5 до 100 микрона, максималната скорост брой - 10 сек.
измерване грешка поли устройство стирен латекс концентрацията на 4.1 микрона в диаметър е 10 до 15%. Независимо от това, следва да се отбележи, че това устройство има редица недостатъци, които са характерни за интензивността на методи за запис с помощта на преден разсеяна светлина. Основните от тях - е зависимостта на резултатите от измерванията от коефициента на пречупване на изпитвания обект, който е особено случаят, когато изпълнението където максимални броячите на частиците са предмет на трептения (вид на плато порции или вдлъбнатини тип) [50]. Това може да доведе до факта, че изпълнението може да бъде двусмислено (особено в диапазона 0.5-2.0 микрона). Ето защо, в тези случаи е необходимо да има предварителна информация за калибровъчни криви на обекта и използвате.
[52] описва лазерен анализатор биологични течности, също изградени на базата на светлина откриване, разпръснати обекти. Въпреки това, за разлика от описаната по-горе светлина единица се отчита в тесен ъгъл от 20 °, зрителен ъгъл от 0 = 30 °. Тази схема позволява надеждно откриване на частици с относително индекс на пречупване в обхвата от 1,01-1,50. Сигналът от фотодетектора също се записва амплитуда анализатор. За хидродинамичен тест течност фокусиране камера използва стъклена тръба, която, въпреки че е най-простите известни камери, но има високи изисквания към качеството на производството на малък вътрешен диаметър и оптичните характеристики на материала. Размерът на обема на измерване е 200 микрона. Експериментални изследвания са показали, че устройството може надеждно откриване на частици с размери по-големи от 1 микрон, с обхват на измерените концентрации -5-106 * 10 мл-1. Изследвания на разредени суспензии на биологични обекти размера на 3-10 микрона.
Следва да се отбележи, че за даден тип броячи частиците показания ще зависят силно от индекса на отражение на обекта на изследване и в диапазона от 1-2 микрона може да се появи на изпълнение на вида на плато порции или вдлъбнатини, т. Е. Също така трябва да има априори информация за обекта.
Мултипараметрения цитометрия на траекторията на полета. В серия от документи [53] разработи многомерна подход към TOF лазер цитометрия на базата на разсейване на светлината, понякога в комбинация с microfluorimetry. Едновременно с това, редица на измерените сигнали от отделни клетки, като интензитета на разсейване напред и 90 ° - общия интензитет на ортогоналната разсейване и интензивността на своя компонент поляризирана в равнина, перпендикулярна на падащата светлина поляризация и посоката на полета на клетки на така наречените деполяризация компонент Ih` интензивност на разсейване ъгъл гама 1.0-2.6 ° 3,0-11,0 ° и - интензивността на странично разсейване светлината на две дължини на вълната. Има и други възможни комбинации от сигнали.
Този подход прави доста ефективно диференцирани кръвни клетки в тяхната морфология. Например, еозинофилни гранулоцити могат да бъдат разделени от неутрофилни гранулоцити. Тази способност е важно за практика, както и за теоретични изследвания в площ- имунологията. В този случай, информация за типа на клетката определя от съотношението на интензитета на разсейване и ортогонална деполяризация компонент. - 0.013 (неутрофилни гранулоцити) - 0.007 (моноцити) - 0.044 (еозинофилни гранулоцити) 0,008: където абсолютните стойности на следните стойности на коефициента на деполяризация / J _ / (/ _ л + / II) с голямо разпространение на ъгли на приемане на разсеяна радиация (14,5 °) имат (лимфоцити). Важно е, че еозинофилите са голям брой малки вътреклетъчни частици (гранули, даде сравнително високи коефициенти на деполяризация. Това потвърждава факта, че не е последната роля в процеса на множествена разсейване на излъчване на деполяризация.
От гледна точка на изпълнение хардуер Многопараметровата цитометрия на може да се проведе при използване на стандартни калибриращи цитометри правоъгълна кварц капилярни или струя от въздух при облъчване лазерна светлина с ниска интензивност (например, Не-Ne, Ar (100 MW)), включително лазери множество дължини на вълните или светлина спектрален лампи (живачна лампа) с лека модификация цитометър за получаване на разсеяна радиация.
Важно е, че резултатите от измерването са представени под формата на карта от два параметъра на екран микро компютъра, отразявайки плътността на пространствено разделени региони записани различни видове клетки. Очевидно е, че е възможно и триизмерната представяне на резултатите от едновременно измерване на три разсейване параметри. В този случай, ние трябва да очакваме още по-голямо диференциране на клетки.
интензивност Две параметър карта ортогонална разсейване и напред разсейване на разтворени човешки кръвни клетки показват добра резолюция разсейване област гранулоцити, моноцити, лимфоцити и еритроцити с клетъчни остатъци. Подобно разделяне е възможно, докато гледат страна разсейване при дължини на вълните 405 и 577 пМ. В този случай, реакцията на площ разделяне цитометър на лимфоцити и моноцити от еритроцити в област отговор поради ниската интензитета на разсейване на светлината с X = 405 нм еритроцити.
Изградени от авторите [53] прост период цитометър основава на He-Ne лазер 5 MW с едновременно записване на четири разсейване параметри се оказва доста надежден инструмент за диференциално броене на четири типа на белите кръвни клетки. Сравнение преброяване резултати извършени на това устройство, и използване на наличен в търговската мрежа транзит цитометър «Technicon H-6000", те показаха добра корелация. Корелационният коефициент е установено, че е 0.99 за лимфоцити, моноцити до 0.76, 0.99 до 0.98 на неутрофилни гранулоцити и еозинофилни гранулоцити за. Имайте предвид, че промишлените цитометри са сложни устройства, които изискват предварително цитохимикали подготовка на обекта на изследване.
В [531 показва обещаващи напреднали техники и анализ на резултатите за бърза диагностика на левкемия измерване. Най-високата информация може да бъде получена от едновременни измервания на светлина разсейване и имунофлуоресцентни характеристики.

Видео: Sorter S3 BioRad клетки