Микроскопия и microspectrofluorometers - лазерни диагностика в биологията и медицината

Видео: Електронна микроскопия на биологични обекти © електронна микроскопия на биологични обекти

7.2. Лазерно флуоресцентна микроскопия
и microspectrofluorometers
Обща информация. Използването на лазери и методи за обработка на цифрови информационни значително повишен Микрофлуорометричен диагностични възможности. От една страна, лазери осигуряват висока спектрална плътност на мощността на излъчване на възбуждане, която е с ниска загуба може да бъде насочена към място диаметър от около един микрометър. От друга страна, използването, заедно с други устройства, свързани с компютърни съвременен видео детекторите, запис ултра интензивност постига свръхчувствителен записване на пространственото разпределение на флуорофори в клетки, диафрагми, мембрани, както и други задачи ефективно, свързани с измерването на малки количества анализираните вещества в различни моделиране среди и биологични структури.
Количествен анализ mikrospektrofluorimetrichesky биологично активни молекули. Схемата е съвсем проста микроскоп лазерна флуоресценция, която е построена на базата на флуоресцентен микроскоп "LUMAM-НА" е показана на фиг. 7.2 [9]. За възбуждане на флуоресценция, като се използва непрекъснат не-Cd лазер (Rx = 441.6 пМ, >Z = 325 нм).

Фиг. 7.2. Схема импулсна флуоресцентен микроскоп: 1 - Laser 2 - модулатор 3> 10 - PMT 4 - телескоп 5 - поле диафрагма 6 - селективен огледало 7 - лещи, 8 - обектът съгласно проучване, 9 - филтър 10 - усилвател-дискриминатори
11 - устройство за взаимодействие с компютър, 12 - компютър "Spark-226" 14 - едното око дюза [9]
засичане на флуоресценция се извършва с помощта на фотоумножител (Пл) в режим на броене на фотони на нивото на един електрон с автоматично изваждане на фона на околната среда и вътрешния Пл шум. Дължина на вълната - 360 - 800 нм, динамичния обхват на измерената светлина поток - 10s, грешката на измерването на потока минимум 10%, диаметърът на възбуждане радиация лъч в наблюдение област 1 - 100 микрона.
Microfluorimeter използва за количествен анализ на аминокиселина за определяне на ДНК съдържание в бактериални клетки. По-специално, хроматографски сканиране петна, получени при разделяне на аминокиселинни производни BPS-CSN-Phe, CSN и CSN-Gly-Jle на плаки, покрити с poliakridnym управлявани надеждно регистриране на количеството вещество в хроматографска място 05/10/14 мол. Този 1.5 порядъка по-добре постигнати понастоящем резултатите от количествено откриване на производни на аминокиселини, разделени чрез тънкослойна хроматография, получената флуоресценция възбуждане с ксенонова лампа.
Един от основните проблеми на съвременната клетъчната биология е да се определи концентрацията на свободен калциеви йони, [Са2 *] вътре в живи клетки. Тази задача се решава чрез успешно лазер microfluorimetry използвайки флуоресцентни сонди. Да разгледаме например метода на измерване на [Са2 +] в изолирани мускулни клетки [10]. Като сонда се използва багрилото индо-1, с максимална абсорбция в комплекс с Са2 + при 331 нм, флуоресценция максимум при 398 нм и флуоресценция квантовата ефективност на 0.56. Флуоресценцията се възбужда от радиация не-Cd лазер (Х = 325 нм) с мощност на сондата светлина е по-малко от 1 MW.
Процедурата за измерване се състои в определяне на съотношението на интензитета на флуоресценцията при две дължини на вълната = 422 и Х2 = 468 нм: /?=/(H1)//(A.2) и допълнително изчисление но формула [Са2 +] = S6D (Rmin-R) / (R-Rmax), където Rmin и Rmax - R et0 стойности нула и насищане Са2 +, съответно, 0,972- с = константа на пропорционалност &г = 250 нмол / л - дисоциационна константа. Ценности RMM, #max, и R са определени по калибриран разтвор на 6 мкмола багрило.
Използването на такава инсталация първата срокове за определяне на характерни стойности на [Са2 +] в диапазона от 100-300 нмола / л в живите клетки с точност от ± 10 нмола / л с пространствена разделителна способност от 2 микрона по-малко от 0.5 секунди.
Един от практическите приложения на лазерни microspectrofluorometers е идентификация и изследване на свойствата на оцветители и багрила в живите клетки. Примери за такава работа са експерименти за изследване fotopovedeniya едноклетъчни водорасли, които по този метод се определя органел, служещи като фоторецептора и photopigment молекула [P. 7].
Друг пример - регистрация в живите клетки на флуоресцентни спектри фоточувствителни тип багрило хематопорфирин, широкото използване в медицината, която започва във връзка с развитието на ефективни методи за диагностика и лазерно лечение на злокачествени тумори. По-подробно този пример ще бъде обсъдено в 7.3. Joi]
Обща характеристика на тези произведения е използването на импулсни настройващи лазери и кинетичната измерване с висока времева разделителна способност.
Инструментална база модерен флуоресцентна микроскопия с изключение на лазери и PMT в режим на фотон преброяване включва видео детектори, работещи при много ниски нива на интензивност на флуоресценцията в извадката кадри, последващото им въвеждане в компютъра и цифрова обработка. Videomikrofluorimetry има редица функции, които са важни за биомедицински изследвания: обработка на информация бързо, силно чувствителни откриване, цифров форматиране и анализ на данни, съхраняване и натрупване на информация за пространствени отношения. Тези характеристики дават възможност за регистрация на времево и пространствено разпределение на флуоресцентни компоненти в изпитвания обект с бързина и точност преди недостижима чрез други методи. съхранение на видео, магнитен диск не само осигурява 100% надеждност на тяхната повторна употреба, но също така позволява на изследователя да многократно се отнасят до тях, за целите на математическа обработка на различни алгоритми.
Microfluor анализ на вътреклетъчен транспорт. Цифровият представяне на изображения на флуоресцентен обект е особено важно в изследването на разпределението на молекули на клетъчни мембрани, вътреклетъчен трафик частици раздробяване на специфични сонди в клетката, и клетъчния мотилитет.
Например, понастоящем, за да се проучи взаимодействието на хормони и растежни фактори за клетъчната мембрана рецептори и последващо интернализация. Една от целите на този документ е да се изясни механизма на разстройства на регулиране на растежа на раковите клетки. Най макромолекулен лиганд се свързва към клетката по време на ендоцитоза чрез рецептори. Комплекси лиганд - рецептор обвити общо мембрана, образувана от отделните секции на плазмената мембрана на клетката. Образуваните затворени капсули се транспортират в клетките чрез специфични адреси, като ядрото. Този вид транспорт в живи клетки и може да се визуализира, използвайки флуоресцентни антитела, свързани с везикулите. цифрови процедури за усредняване позволяват изображения, за да изучават характера на движение на затворени мехурчета при такива ниски нива на възбуждане, която визуално в флуоресцентни мехурчета микроскоп просто неразличими от фона.
Като друг важен проблем могат да се споменат измерване на транслацията дифузия мембрана в равнината и в относително тънък триизмерен обект. Този проблем е решен с помощта на фотоизбелващ техники. В основата на тези методи е фоторазпад на локални области на обекта тест носещ флуоресцентни молекули, за да се промени техния флуоресценция и измерване на кинетиката на възстановяване на флуоресценция поради дифузен приток nondiscolored флуорофори от околната среда в региона осветен от лазерния лъч. Тази област може да бъде под формата на петна, ивици или друга форма.
Кинетиката на възстановяване на флуоресценция, свързани с коефициент на дифузия или скоростта на потока на белязани молекули [II]. Например, в случай на двумерен възстановяване флуоресценция в дифузия ограничен обект дифузия е пряко пропорционална на квадрата на радиуса на лазерния място в обект равнина, и обратно пропорционално възстановяване на флуоресценция време на половината от първоначалното ниво. Окончателното към който възстановеното флуоресценцията, свързана с подвижната част на белязани молекули.
Понастоящем няма друг метод не дава сравнима информация за транслацията мобилността на молекули в някои области на мембраните на отделните клетки или клетъчни органели. Основните етапи на експеримента са:
флуоресценция регистрация от предварително избраната област на мембраната, или на повърхността на тънък филм размера на обект на няколко mikrometrov-
импулс облъчване лазерен лъч тази област (обикновено не-Cd или Ag), бързо разрушават много от флуорофори време 5-50 микросекунди, така че интензитета на флуоресценция на тази област драстично padaet-
измерване на кинетиката на възстановяването на флуоресценция, тъй като в края на пулса на белина, която се ръководи от изследвана област ниска мощност "измерване" лазерен лъч (обикновено 103-105 пъти по-слаби), вълнуващо флуоресценция по същия начин, както в първия етап.
При извършване на такива експерименти флуоресценция регистрация може да се извърши с фотоумножител. Въпреки това, използването на видео системи може да осигури възможност за изучаване на процеса на възстановяване на пространствената детайл, който дава възможност, по принцип, местните ценности брой на коефициентите на дифузия или скорости на потока в зоната за проучване, като вътре в клетката.
измерване на кинетиката на възстановяване флуоресценция след фотоизбелване метод, използван за изследване на агрегация на макромолекули и процеси на самосглобяване на клетъчни органели. Например, по този метод, са изследвани посока и механизъм на микротубулната полимеризация. Както е използван флуоресцеин флуорофора. Измерванията позволяват да се изключи хипотезата, съгласно която мономерите включват тубулин в микротубулите в средната част и загубени в крайната част на х.
Ние изследвахме кинетиката на полимеризацията на глобуларен актин във воден разтвор в присъствието на КС1 сол или двувалентни катиони Са2 + и Mg2 +. В процеса на полимеризация се образуват дълги (10 - 100 микрона) F-актин нишки. Това е първото доказателство, че останалите не-полимеризиран актин фракция в присъствието на нарастващи нишки е мономерна форма на G-актин.
Тази техника позволява точно да се проследи влиянието на различни реагенти в процеса на самосглобяване. Например, добавянето на резултатите цитохалазин В в скъсяване на нишките и добавяне на разтвор aldolazy - протеин, който се свързва към актинови филаменти, - слабо увеличава мобилен фракция на актин. Най-вероятно това се дължи на образуването на напречни връзки между нишки aldolaznyh F-актин.
Най-интересни са експериментите с живи амебите. Чрез микроинжектиране в клетката се инжектират с флуоресцеин-белязани протеини: G-актин, говежди серумен албумин (BSA), овалбумин и рибонуклеаза А. измерените стойности на дифузията на протеинови молекули в клетката са в 2-3 пъти по-ниски съотношения, отколкото във вода. Освен това, беше установено, че молекулите на G-актин, че тяхното молекулно тегло е 50% по-малко от това на BSA молекули дифундират по-бавно от BSA молекула. Това потвърждава хипотезата, представени по-рано, че клетка G-актин е комплексиран с други молекули на значителен размер тип профилин.
В допълнение, кинетиката на възстановяване на флуоресценция след избелване наблюдение показва, че фиксирана част на F-актин е средно около 10% от общия актин в клетката. В различни части на съотношението на клетката е различна: в опашката - вече, по-мобилни глава част - по-малко. В областта на плазмената мембрана съдържа до 50-80% неактивни нишки. Тези и други изследвания (например, самосглобяване на микротубулите), показват, че методът на фоторазпад е много ефективно не само за измерване на мобилността на мембрана, но също така и в изследването на транспорта на макромолекули, в разтвор и в междуклетъчната матрица.

Видео: Медицински микроскоп XS-90