Примери за лазерни флуоресцентни диагностика - лазерни диагностика в биологията и медицината

Примери за лазерно
флуоресценция диагностика в медицината
Раковите диагностика. Досегашният опит лечение на рак дава основание да се смята, че ранното диагностициране на рак, следван от хирургична или терапевтична (вероятно лазерен) лечение могат значително да увеличи вероятността от възстановяване. В тази връзка, на различните изследователски центрове, включително и тези в нашата страна да търсят нови и по-ефективни методи за диагностика. Преди използването на лазери Установено е, че флуоресцентният спектър във видимия диапазон, получени от нормални и туморни тъкани се различава. Прилагане на лазерно флуоресцентни спектрометри с висока спектрална плътност на мощността на възбуждане е възможно да се увеличи скоростта и качеството на получаване спектри и повишаване на общото ниво на изследвания в тази посока.
Фиг. 7.3 показва флуоресценция спектрите, получени от нормални и туморни бъбреците и простатата плъхове [12, 13]. Може да се види, че основната максимуми на спектрите на туморна тъкан (А = 521-522 нм) е значително изместен към синята област в сравнение с здрави (А = 531-533 нм). И много формата на спектрите различава значително. Тези различия в флуоресцентен спектър, очевидно, трябва да бъдат наблюдавани в изследването на човешки тъкани и органи. Тези различия се обясняват с промените в околната среда или околните флуорофори или производството на нови флуорофори предизвикани биохимични промени в клетки или в тяхната среда. С дължина на вълната А = 520-530 нм флавините флуоресцират, флуоресцентният спектър максимуми са малко изместен в зависимост от условията на околната среда. Ето защо, ако не говорим за производството на нови флуорофори, може да се предположи, че в този случай, флуоресциращи флавините. Общи пикове в спектъра в региона = 590-640 нм могат да бъдат приписани на порфирини съдържащи се в митохондриалния цитохром. Тяхната флуоресценция се увеличава при отстраняване на Fe и Cu йони.

Фиг. 7.3. флуоресценция спектрите на бъбреците (и) и простатата (б) на плъх: 1 - здраво тяло, 2 - тумор

Фиг. 7.4. Схема лазер флуориметър: 1 - Ar лазер, 2 - хеликоптер 3 - обект 4 - фокусиране система, 5 - монохроматор 6 - Пл, 7 - усилвател 8 - записващо [121

монтажна схема, в която спектрите са получени по-горе, са показани на фиг. 7.4. Непрекъснато радиация Ar лазер (= 488 нм) модулирана от хеликоптера с честота 200 Hz, фокусирани върху повърхността на тъканта. Флуоресцентно сигнал, използвайки система от лещи насочва към вход процепа на двойно монохроматор, който извършва сканиране на спектъра с резолюция от DL = 1.8 пМ в обхвата от 800 пМ = 500, така че разсеяната светлина, падаща върху фотоумножи. PMT сигнал в синхрон с хеликоптера усилва и записва с. Сонда лазерна мощност е 100 MW, радиация, диаметърът на място в измерването - 100 микрона. Спектрите бяха записани няколко пъти, и в същото време те наблюдава пълно възпроизводимост.
Имайте предвид, като настрана, че едно и също растение може да се използва за диагностика на зъбен кариес. Показано е, че съществуват значителни разлики в спектрите флуоресценция и еластично разсейване във видимата област на кариозни и здрави зъби области. Повече информация намерите заинтересования читател да [14].
Друг обещаващ метод за лазерно флуоресценция ракова диагноза въз основа на способността на злокачествени клетки и тъкани натрупват повишен в сравнение с нормални клетки и тъканни концентрации на флуоресцентни бои [15, стр 36]. Провеждане на оптичен проверка на тъкани в спектралния диапазон на флуоресценцията на багрило позволява бързо откриване поставя повишена му концентрация, и следователно, тумор локализация.
Използването на лазери по този начин е от основно значение не само от гледна точка на необходимостта от висока спектрална плътност на мощността на излъчване, но също така и от гледна точка на необходимостта да се използва пътеки оптични за подаване на възбуждане излъчване на вътрешните органи и изпускателната флуоресценцията от тях.
Изборът на оптимален багрило за флуоресценция диагностика на тумори се провежда в съответствие с редица изисквания. Багрилата трябва да се характеризират: висока селективност на натрупване в злокачествени клетки и тъкани (в сравнение с нормата), висок квантов добив на флуоресценция, бързото отделяне от тялото, липсата на странични ефекти върху тъканта и организма като цяло. Той не трябва да бъде висок квантов добив синглет кислород поколение предизвикано от светлина или други агенти tsigotoksicheskih разлика от противоположни изисквания за багрила, използвани за фото динамична терапия на тумори.
Понастоящем лаборатории се развиват техника на лазерна флуоресценция диагноза на рак, тя често се използва като оцветители хематопорфирин (HP) хематопорфирин производно (HPD) [P. 36, 16, 171 и flyurenat (флуоресцеин динатриева сол) [15, 18]. Докато първите две багрила се използват също за фотодинамична терапия flyurenat е по-подходящо за диагностика. По този начин, тя осигурява разлика от наблюдението на тумор флуоресцентна светлина на фона на нормална тъкан е не по-малко от 50: 1, в сравнение с 5: 1 в GWP.
За възбуждане на флуоресценция flyurenata най-подходящата радиация Не - Cd лазер (А = 441.6 пМ), което попада в нейната абсорбционна ивица. В присъствието на пациента, кръвта се въвежда flyurenat, злокачествени тумори, като например стомашно-чревния тракт, туморът свети светло зелена светлина на тъмно син фон незасегнати лигавица. Това луминисценция със сигурност 98% съответства на местоположението на тумора. Мъртвата тъкан дава не-светлинен части. Такива области често се наблюдават в големи тумори, които светят по-слабо като цяло.
В някои случаи, площта на емисиите с лазерно възбуждане е значително по-висока от тумора, видима при нормални условия на осветеност. Това означава високо проникване на раковата тъкан в стената на тялото. Това наблюдение ни дава възможност да се планира работата правилно.
Метастази са осветени, както и тумори. Прилагане на флуоресценция диагноза значително увеличава процента на тяхната идентификация. В някои случаи само чрез флуоресценцията открити под формата на интра-органна метастази просо обрив от тумора.
Интересно е да се отбележи, наличната практика в случаи [15], както при пациенти с диагноза на рак, като на дебелото черво, определен от палпация и рентгенова са наблюдавани флуоресцентна светлина. Дори по време на операция на рак на диагнозата не е под съмнение. Въпреки това, последващо хистологично изследване не потвърждава тази диагноза: възпалителни инфилтрати, са объркани с тумор. Его показва висока надеждност диагностика лазерна флуоресценция.
В момента продължава работата на клиничното изпитване на този метод и за изследване на механизмите на селективно натрупване на багрила в ракови клетки [17, 19], а също и за изследване на механизмите на фотодинамична щети биомолекули, клетки и тъкани на биологични структури [20, 211. Една важна стъпка в тази работа е изследване стационарни и време на флуоресценция спектри на багрила в разтвори и живи клетки се извършва с помощта пикосекундни лазерни спектрометри и microspectrofluorometers на.
В [22, 23] са записани флуоресцентни спектри GP, GP диацетат (ВРН) и digematoporfirinefira (Photofrin 2) във водни разтвори (рН = 4,0-11,0) във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PU = 7.4) и в диметилформамид разтвор в моделни системи: изкуствени липидни везикули - липозомите и еритроцитни сенки, както и в култивирани прасе бъбречни клетки и човешки фибробласти.
Монтаж диаграма, на която са получени спектър, показан на фиг. 7.5.

Фиг. 7.5. Схема пикосекундни флуоресцентен микроскоп: 1 - фокусираща леща 2 - обект 3 - монохроматор 4 - Пл 5 - фотон брояч, 6 - микро-компютър [22]
Флуоресценцията беше възбуден с единични импулси или втората хармонична на YAG лазер Nd: продължителност, багрило лазерен импулс от 70 ± 10 к.с.. Кратко обектив хвърлей фокусиран лазерен лъч възбуждане на даден обект и събира флуоресценция. Диаметърът на лъча в зоната на наблюдение е по-малко от 1 цт. Флуоресцентна светлина насочва през

прозрачна в обхвата от 600-700 пМ огледало дихроично в монохроматор и в режим на работа на фотоумножител fogonov профила. Цялата система се управлява под контрола на микро-компютър.
В клетките на главния максимума на спектъра флуоресценция попада при 635 нм. Стационарни спектри са пикове при 612 нм за водни разтвори при 625 нм и - за

Фиг. 7.6. разпределението на интензитета на флуоресценция на човешки ракови клетки, чувствителни GWP [25]
органичен разтворител. Това предполага, че естеството на флуоресценцията на молекулите на боядисване по същество зависи от тяхното незабавно среда (водни молекули, разтворители и други липиди.).
Кинетичните измервания са показали, че естеството на разпад на флуоресценцията зависи от багрилото молекули са под формата на мономери или техните агрегация възниква и комплексообразуване с други такива вътреклетъчни структури. Така флуоресценция разпад кинетиката на GP на мономер разтвор във вода в региона на максимално симулирани с добра точност от един експоненциално с време Т = 15-16 не. Появата на агрегати в разтвор (олигомери) багрило включва появата на още "бързо" експоненциално с т = 0,5 NS. Бърза кинетика също се появява в лентата на основното максимума на флуоресценция спектрите на молекулите на боядисване в клетки, което показва, че тези молекули образуват комплекси с вътреклетъчни структури могат да мембрани.
Чрез увеличаване на дозата на излагане на светлина в разтвори за боядисване като стабилни фотопродукти които в тяхната кинетични и неподвижни странични ивици флуоресцентни спектри с пикосекундни гниене (за GP? .tah = 644 нм, Т = 100 PS) [24]. Фиг. 7.6 показва пример за измерване на разпределението на интензитета на флуоресценция на клетките на човешки рак след 1 час съдържание на своята разтвор GWP [25]. Концентрацията на боя е 50 г / см3, плътността мощност на излъчване на аргонов лазер върху клетъчната повърхност - около 0,4 MW / cm2. Съотношението сигнал / шум е в района на няколко десетки максимална флуоресценция. Измерванията се извършват върху микроскопа на лазерния флуоресценция оборудвани със система за силно чувствителни откриване, цифрова обработка и представяне на изображения.
Може да се види, че интензитетът на флуоресценцията е по-ниска в централната част, отколкото в периферните участъци. Този резултат означава, че GWP натрупва предимно в външната мембрана на култивирани ракови клетки, който съответства на резултатите от други автори [26]. Предвид този факт, както и представяне на комплексни багрила към мембрани, може да се предположи, че разрушаването на ракови клетки в фото динамична терапия на тумори развиват главно в клетъчните мембрани.
В тази фигура, минималните размери картина елемент площ съответстват на 0.25 мм на обекта, който е на ръба на пространствената разделителна способност на оптичната система. получаване на флуоресцентни изображения на времето е 1 и за разлика от няколко десетки секунди необходими с конвенционален изкуство, освен като недостатъчно пространствена разделителна способност.
Увеличаването на всяка година броят на произведения в областта на разработка и тестване на лазерна флуоресценция диагностика на злокачествени образувания техники ни позволява да се надяваме, че в близко бъдеще, тези техники, заедно с лазерна терапия, фотодинамична рак заеме твърда място в клиниките.
Диагностика на миокардна исхемия. Много флуорометрично изследване на живи клетки, основаващи се на откриване на съотношението на концентрацията на редуцирани и окислени форми на Пиридин-нуклеотиди [NADH] / [NAD +], е коензим на много вътреклетъчни реакции. Тази нагласа носи важна информация за състоянието на клетките и се състои от тъкани и органи. Неговата способност флуоресценция регистрация определя от свойствата на NADH абсорбира светлина при дължина на вълната Xi = 340 нм и маркирайте връх флуоресцентна дължина на вълната А2 = 480 нм. NAD + при дължина на вълната не абсорбира, и флуоресценция в областта на R2 е много по-слаба.
Един интересен пример на този подход е регистрацията на миокардна исхемия при нормални физиологични условия [13]. Характерна особеност на кръвоносните перфузирани органи

Фиг. 7.7. Схема лазерен оптичен флуорометър [13]
Той е силно смущение въведени в флуоресцентният сигнал на циркулация тъкан кръв. За да се компенсира това смущение е възможно чрез едновременно записване на интензивност на флуоресценция от дължината на вълната и интензитет на отразената радиация плата при максимална абсорбция групата на хемоглобин (R3 = 805 нм).
4on Фиг. 7.7 е диаграма на влакна лазер флуорометър създаден за такива измервания. Устройството включва два лазер: азот (/) и багрило (2), като източници на UV и IR радиация, две фотодиоди (3), съотношението на запис на изходните силите на лазери, две PMTs (4) за измерване на интензитета на флуоресценцията, предизвикани от UV радиация и интензитет на отразената инфрачервена радиация. Тази схема, разбира се, снабдени с електронен блок и микрокомпютър. азот лазерни параметри: импулс честота на повторение от 140 Hz, енергията на импулс от 150 MJ, върховата мощност от 30 кВт, средна мощност при скорост на повторение на импулса от 100 Hz -

MW. лазер времетраене на импулса на багрилото в същото повторение честота - 6 не.
Като илюстрация на резултат от прилагане на описаното устройство за запис на сърдечния мускул исхемия на фиг. 7.8 показва време зависимостта на интензивността на отразената светлина (/) и флуоресценцията (2) по време на исхемична атака (спре перфузия), изолирани перфузирани сърцето модел на плъх. Намаляване на размисъл

Фиг. 7.8. Кинетиката на промяна на отражение (1) и флуоресценцията (2) по време на атака исхемия, индуцирана сърдечен арест krysy_ перфузия (TX на време) и възобновени след 50 сек (Т2 време)
Това се осъществява чрез намаляване на концентрацията на интерстициални червени кръвни клетки, докато увеличението на интензитета на флуоресценция се дължи на увеличаване на вътреклетъчната съотношение [NADH] / [NAD +].
флуорометър Лазерната влакно може да се използва успешно в операции на сърцето за изследване на метаболизма на сърдечния мускул през катетъра провеждащ светлина. Освен това, очевидно е, че всяко тяло, което е достъпно за fiberscope или катетър може да бъде обект на изследване с такава флуорометър. Имайте предвид, че nonlaser флуориметър, преди построен на базата на живачна лампа, монохроматор, филтри и UV микроскоп, не позволява да се получат надеждни резултати дължи главно на липсата на чувствителност.
Диагностика на атеросклероза. Друг обещаващ прилагане на флуоресценция диагностика в медицината се превръща диагноза на атеросклеротични плаки и, в частност, влакнести плочи, които са на първия етап на атеросклеротични съдови лезии.
Както е показано в [26], в присъствието на атеросклеротична плака в съд може да бъде определена чрез сравняване на интензитета на флуоресценция при дължини на вълните от 580 и 600 нм с възбуждане при 480 нм. Фиг. 7.9

Фиг. 7.9. флуоресценция спектри на нормата (/) и атеросклеротични (2) артерии [26]
Тя показва характеристика флуоресцентни спектри, получени от нормални и атеросклеротични артерии. Тя може да се види, че те са много по-различно.
Използването на факта, че височината на пика при 600 нанометра по отношение на минималната дължи 580 нанометра, е много по-голяма в случай на здрави артерии, в сравнение с поражение, можете да направите контраст / (600) // (580). Значението на тази връзка, получени в експерименти потвърждава съответната хистологичен анализ, е приблизително 2 до приблизително нормални артерии и атеросклеротични 1.
Многобройни опити показват, че може надеждно да се прави разлика между нормалната артерия и артерия плаки с дебелина 0.5 mm или повече. И въпреки че досега получените само на трупове артерии резултатите, могат да разчитат на директни лазерни диагностика на атеросклероза ин виво чрез катетъра светлина водеща скоро ще стане възможно. В случай на положителна диагноза може да бъде по същия катетър за предаване на високи дози на лазерно лъчение в лезията на атеросклероза, за да унищожи плаки.