Култивиране техники токсичен mikromitcetov - toksinobrazuyuschie микроскопични гъбички

ГЛАВА 4. и отглеждане техники Mikromitcety токсични и ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ТОКСИЧНОСТ

Методи за изучаване на токсични гъби са много разнообразни и по много начини, подобни на методите на микологични и микробиологични изследвания. Това - разпределението на зърно и фуражни продукти, както и отглеждането и идентификацията на токсичност.
Правилното вземане на проби е от съществено значение за успешното изучаване на гъбични флора. За анализ микологичен взета проба с тегло около 200 г се взема проба от средната проба, съставена от конвенционален метод: сондата от различни места. В зависимост от обстоятелствата, методи за вземане на проби може да варира, но трябва да се направи едно условие: необходимо е, че получената проба може по-пълно да показва състоянието на фуража в партида за тестване.
Проучването на гъбични флора трябва да се направи на първо място в центровете заподозрени да се хранят лошо качество. Те обикновено са ясно видими, както и слотовете или затъмнена междинния слой често специфична миризма на мухъл.
Ако микоцидна проучване на продуктите или фуражи поради необходимостта да разберете причините за болести при хората или животните, в допълнение към информацията, дадена в приложените към етикета на пробата (името на икономиката, час и място на вземане на проби), също така е желателно да има данни поне за основните признаци на прогресия на заболяването.
В лабораторията прави обща проверка на пробата. За тази цел тя се разпростира на чиста, бяла хартия е най-добре и да произвежда инспекция. Взети предвид общото състояние на пробата: нормална или анормална оцветяване, присъствие или отсъствие на видими признаци zaplesneveniya, гъбички (например, ръжда или главня) отбеляза растения по време на вегетация, наличието или отсъствието на плесен миризма и т.н., стъбла, листа, съцветие с видян на .. те гъбични заболявания изследвани с микроскоп. Препарати за гледане под микроскоп се получат чрез остъргване на гъбични dernovinok плака, sporokuchek и т. D. Те остъргват чист скалпел, прехвърля се капка вода върху предметно стъкло, покрита със стъклен капак и сърфиране. За откриването на спорове или да образуват спори съди вида често също от вида и степента на развитие на гъбички по емисия тест. В присъствието на проби спорофори този метод за анализ с внимателно изпълнение на последователно своите добри резултати.
За да се определи степента на слама поражение Св алтернанс проф. NA Наумов (1937), предложен метод за промиване спор с тестовата проба фураж. За тази храна проба и се нарязва на сламата на малки парченца, поставени в колба е напълнена с чиста вода до целия слой и потапяне в продължение на 20 минути се разбъркват периодично. Получените по този начин суспензия спори чисти капки пипетата прилагат върху стъклени слайдове (поне 20 капки). Капки покрити със стъклен капак и гледане под микроскоп.
Този метод може да се прилага успешно да се определи наличието на субстрат на други видове гъби, спори формиране на повърхността, но при условие, че спорите се отмива лесно с вода. Ако суспензията на спора оказва достатъчно дебел, което го прави трудно да се направят ясни заключения, след това водната суспензия на конуса трябва да се отделя, утаява спори в центрофуга и утайката се изследват, както обикновено.
Използването на тези два метода ще се установи наличието на замърсяване на субстрата с много видове гъбички. Въпреки това, при определянето на гъби Спорове далеч не винаги е възможно, все пак, като се използва методът на терени, както и други органи, намиращи се в препаратите. В допълнение, примерните гъбичките не винаги идват под формата на спори, а често само в мицел етап. Освен това, мицел може да бъде, поне в голямата си част вътре в зърното, стъбла и други растителни органи. Определете вида на гъбен мицел само няколко изключения, почти невъзможно. За проучване на сапрофитни гъби да ги хранят в повечето случаи трябва да растат или дори изолиран в чиста култура. Ето защо, като допълнение към първата от горните методи, че е много удобно да се използва така нареченият метод натрупване. субстрат тест се нарязва на парчета (ако е зърно, като цяло) и се прилага към стерилни петриеви панички на няколко слоя от стерилизира филтърна хартия. След това се добавя към плаките, стерилизирана вода в количество от 5 мл на съд с диаметър 12 cm и се оставя да престои при температура от около 25 ° С Трябва да се избегне образуването на излишък от вода, тъй като наличието на воден филм върху повърхността на храната забавя растежа на много гъбички. Гъбички, в основата са в по-голяма или по-слабо развита държава, обикновено на втория или третия ден даде изобилен растеж. Растежът на спори на повърхността на субстрата се забелязва само в рамките на няколко дни.
Развитието на гъби в пробата се наблюдава в продължение на една седмица. Понякога животът е повишен, ако е необходимо, за да се проследи развитието на някои видове гъби. За да се избегне изсушаването на субстрата в чаша при разширяването на наблюденията в него се добавят няколко милилитра стерилна вода. Анализ на гъбична флора се прави най-добре с бинокъл лупа с увеличение на 24 за изследване на някои спорофори понякога нужда от по-силен ръст. Този метод дава възможност за по-пълно анализ на видовия състав на сапрофитни гъби. В интерес на изследователи гъби прострелян дисекция игла или скалпел, приложена към стъкло и го изследва под микроскоп.
Изолиране на чисти култури от този метод на изследване се извършва много просто. За тази игла със стерилна платина конидиофори или спорангий в зрителното поле на лещата на отстранява повече спори, които след това се прехвърлят в среда в епруветки. Забележете някои конидиофори много гъби и премахване на тяхната конидии платина игла може да бъде като се възползва от увеличаване до 24.
Този метод, комбиниран с изстъргване дава задоволителни резултати. Гъби, които са заразени зърно или груба храна, лесно открити, ако петриеви блюда с пробите се поставят в термостат при 37 ° С
За изолиране на чисти култури от гъбички от субстрата може да използва метода на промиване. За тази цел, след 20 минути разбъркване проба в стерилна вода и конус със стерилна суспензия, получена в количество от 0.5 мл, са взети със стерилна пипета и се прехвърля в стерилна епруветка, към който се прибавя 4,5 мл стерилна вода. След разклащане сместа се поставят върху агар среда в блюдо на Петри. Засяването произвеждат по-добре чрез прибавяне на 1 мл от суспензия до 9 мл разтопен и се охлажда до 45 ° С в агаровата среда, след което се излива в петриеви панички. Както колониите на чашките направени субкултури спорите или мицелния в отделни тръби или плочи с хранителната среда. По-конкретно, този метод може да бъде модифициран. Въпреки това, за да се получат чисти култури от гъбички от зърнени продукти и фуражи има ограничена стойност. Първо, не всички гъбички, които удрят субстрата могат да бъдат във фаза на спорулация и, както е споменато по-горе, не всички спорове са еднакво достъпни smyvu- от друга страна, може да се измие гъбични спори, съгласно техните биологични характеристики, които не са способни на захващане на вижте извадка ин виво и затова са sluchaynymi- Трето, видовете, които ще излезнат на основата на архитектурната среда често могат да бъдат подтиснати само случайни гъби и предотвратяване на растежа.
Разпространението на зърнени култури, мораво рогче склетория се определя от наличието ( "рога") в ушите на зърнени и фуражни треви или зърна засечка по съществуващите счетоводни правила. За да се определи ergotoxine в брашно се използва за качествено реакция сода. Propis настоящото реакция и Mishustin Trisvyatskomu. Към 10 г брашно, 20 мл етер, подкиселява се с 1 мл от 10% H2S04- след разклащане на затворената тръба се оставя за 6-12 часа, за да се извлече токсин и след това се отделя от естер чрез филтруване на брашно. Към филтрата се прибавят 2 мл разтвор на сода (1: 14) и се оставя да престои известно време. В присъствието на моравото рогче седимент става ясно, лилаво. чувствителността достига 0.05%.
* Примес зърно главня определя чрез директно преброяване на заразените семена и спори в пробата за изпитване. Отчитане атомизирани главня спори в пробата за изпитване се произвежда чрез промиване с вода и зърно, чрез броене камера.
Подходящ за използване разследван партиди от храни и фуражи, зърнени храни, се определя в съответствие с действащите държавни стандарти. Степента на заразяване на зърно покълнали гъби се определя на не по-малко от 400 зърна от различни части на пробата чрез преки броене и микроскопия порции мицел, произхождащи от болни зърна с последващо определяне на видовете в изолирани чисти култури. Необходимо е да се вземе предвид, че недостатъчност, особено видове Fusarium, може да се получи както по време на завод растителност, както и по време на съхранение, което при благоприятни метеорологични условия (влага) за дълъг период от време може да бъде значително. С дълбоки поражения на ухото по време на вегетация фузариум зърна лесно се различават от външния им вид: спаружени бледо розово-червено-кафяв цвят, често на повърхността да има розово или оранжево или Sporodochia slizevidnye pionnotes.
През първия период на наблюдение обикновено се появява на зърно (например, Fusarium) бял пухкав мицел, често без да образуват спори. По това време, удобно да отпаднат в епруветки, за да се получи култури. С дълбоководни видове лезии Aspergillus, Penicillium или други, в началото на периода и се извършва преброяване заразени храни и изолационни култури. В растежа на седем дни се установи степента на увреждане се определя чрез микроскопски и основните гъбични видове.
За изолиране на гъбички, които разрушават целулоза спорова суспензия може да се поставят върху стерилна филтърна хартия, поставена на дъното на стерилна петриева паничка и навлажнена с течна синтетична хранителна среда без добавяне на въглеродни източници.
*
Хранителна среда за култивиране на чисти култури от гъбички

1. неопределена среда: а) естествени (стъбла, зърнени храни, зеленчуци, мляко и т.н.) - б) изкуствени, получени чрез обработка на естествени субстрати ...
2. Дефинирани среда (синтетични), които винаги са изкуствени.

Последователността се различава между плътна (твърдо вещество), полу (полу-твърдо вещество) и течност.
Неопределен среда, съдържаща различни pitelnye агенти най-подходящи за посяване гъбички от естествени субстрати и дългия kultirovaniya. Въпреки това, тези медии имат общ недостатък. Химичният състав на основи, от които те са получени, може да варира в зависимост от различни условия. Така, например, корени, грудки, стебла и други органи дори един сорт растение могат да имат по-голяма или по-малка степен различен състав в зависимост не само от възрастта, но също така и на условията на отглеждане, съхранение, и така нататък. P. Следователно, в точно експерименти повторение на идентичен условия на отглеждане на гъби в тези среди, е трудно да се постигне. Този недостатък лишени синтетична среда. Но с оглед на факта, че те не съдържат хранителни вещества, присъщи сряда неопределен състав, растеж и образуване на спори на много гъби, те често се случват по-лошо. Следователно, съставът на синтетична среда трябва да се избере въз основа на физиологичните характеристики на гъбата. Обикновено синтетична среда, използвани в изследването на физиологията на гъбички за диагностика и изследване на функции култура. Както се посочва Наумов (1937), "синтетични" само на средата може да се разглежда в тесния смисъл на думата, която съдържа само химически чисто вещество. Агар или желатин вече няма да бъде напълно синтетични, тъй като тези вещества не имат постоянен състав. Естествена среда за отглеждането на сапрофитни гъби, изолирани от даден субстрат, най-добре е да бъде получен от същия вид, когато се установи, гъбички. За тази цел, стъблата и често оставя храна растение се нарязва на равни части, подредени в пакет и поставена в тръбата, за които водата тече по такъв начин, че лъчът на дъното на сламки се потапя във вода. Епруветките Така получените с баластни вещества се стерилизира в автоклав при налягане от 1-1.5 атмосфера в продължение на 30 минути. След стерилизация на околната среда е готов за употреба. Средно, състояща се от стерилизирана храна, е необходимо да се използват в някои случаи за изолиране на чиста култура на гъбички, или за получаване на спорофори типични за него. По същия начин, в епруветки може да бъде приготвена среда зърно, нейните продукти, или други храни или хранителни изследвани субстрати.
Природен среда е също често се прави от картофени грудки, корени от моркови, цвекло, както и различни плодове т. П. За тази цел, тези растителни органи старателно измити, нарязани на парчета, съответно, с диаметър на тръбите, в които те се поставят, след това се стерилизира за 30 минути при налягане 0,5 атм , Такива парчета стерилизирани тръби се поставят по обичайния начин гъби. Парчетата изсъхнат доста бързо, че е пречка за растежа на гъбичката. За да се избегне това, се използва Roux тръби имат свиване, на която се опира парче, и резервоар, разположен под водата се излива преди стерилизация. Ако няма епруветки Roux, преди полагане на филийки в обикновени епруветки, те трябва да се намали кратко стъкления цилиндър и налейте вода по такъв начин, че да не се стигне до дъното парче.
За изследването на определени групи от гъбички често се използва стерилизиран ориз. За тази цел се излива в желаното количество в тръбите или конуси, се добавят 2-2.5 обема вода и след това се произвеждат стерилизация при налягане от 0,5-1 атмосфера в продължение на 30 минути. Също среда получава от царевица или други зърнени култури.
На течни естествени среди често се използва стерилизиран обезмаслено мляко. Той се излива в епруветки и се стерилизира чрез преминаващ пара в продължение на три дни в продължение на 20 минути всеки ден.
Изкуствен неопределен среда обикновено се получава чрез използване на агар или желатин. Към течен бульон или екстракт от естествения субстрат се добавя 1-2% 10-20% агар или желатин. След това средата се загрява в кипяща водна баня или в стерилизатора докато желатин или агар не е напълно стопен, след това се излива в желаната блюдото и се стерилизира. Агар среда понякога неопределен състав се подкислява със солна или сярна киселина. Такива носители са подходящи за отглеждане на много видове гъбички и бактерии развитие върху тях в повечето случаи се инхибира. С значително подкиселяване на средата до рН 4, е необходимо да се има предвид, че в такъв агар среда, след стерилизация (особено под налягане) не се втвърдява. Следователно силно киселинното съдържание може да се извършва само след стерилизация чрез прибавяне на стерилизира киселина все още не охлажда агарова среда. Добавената киселина трябва да бъде ниски концентрации - 1: 10, или 1: 15 нормално разтвор. За 1 литър среда обикновено изисква 12-15 мл от разтвора.
При производството на изкуствен медии неопределени (и двете синтетичен и медии) за целите на отглеждане на гъби морфологични проучвания трябва да се избегне въвеждането на излишни количества хранителни вещества, тъй като това често води до развитието на гъбички грозен.
Жълт агар. Средна жълт се разрежда с вода до 7 ° за ареометър Balling (често това се добавят три обема вода), след това към него се прибавя 1,5-2% агар. Впоследствие среда се получава, както обикновено, се стерилизира под налягане от 0,5-1 атм.
Картофена агар. 200 г нарязани, пречистени и obmytogo картофи кипи в продължение на 30 минути в 1 литър вода, след това otfiltrovuyut през марля, се добавя вода филтрат да се направи бивш обема и 1,5-2% агар среда се получава в бъдеще, както обикновено.
Чрез картофен агар често добавят 1-3% глюкоза. Глюкоза насърчава по-интензивен растеж на гъбички, културни характеристики, които се откриват в този случай по-ясно. Въпреки това, големи количества глюкоза, препоръчани от някои чужди изследователи, нежелани, тъй като увеличаването на съдържанието му в околната среда обикновено се наблюдава грозно развитие на гъбички.
Овесена каша агар. 30 г овесени брашно или 125 гр овесена каша кипят в 1 литър вода за 30 минути, след това се филтрува през марля и се прибавя вода към предишния размер, след агара се получава, както обикновено.
По същия начин получен среда, състояща се от брашно или други зърнени култури натрошен зърно (царевица, пшеница), както и на зърното бобови растения.
Когато производството на течности от плодове, листа или сено 50 грама от желания материал се вари в 1 литър вода в продължение на 30 минути, след това отвара otfiltrovuyut, вода се добавя към предишния обем, след това - .. агар или желатин, и т.н. В средата изработен от листа или сено, желателно да се добави източник на въглерод, като глюкоза в количество от 1-3%.
Синтетични медии. Има голям брой рецепти, предложени от различни автори за отглеждане на някои групи от гъбички. В действителност, много от тези среди са подобни по състав и често се различават един от друг по количеството на прилаганите вещества.
При изготвянето на синтетични медийни рецепти се основават на необходимостта да ги въведе в химическия състав на основните компоненти важни за хранене на различни гъбички и са в асимилируеми съединения. Въглеродните източници често са: глюкоза, захароза, малтоза, разтворимо нишесте, глицерол и манитол. За специални изследвания използват различни от изброените и други въглехидрати и алкохоли, както и соли на органични киселини, аминокиселини, които са едновременно източник на въглерод и азот, и т. П. За унищожаване на гъбички целулоза като въглероден източник се използва конвенционален филтърна хартия (за предпочитане безпепелни филтри) понякога - абсорбираща памучна навлажнен с течен минерална среда.
За гъбична медии като се използват различни източници на азот. В същото време се вземат предвид неравномерното способността на много гъбички метаболизма нитрат, амоняк и амино азот. Източниците на нитратен азот са най-често калиев нитрат, натриев нитрат и амониев нитрат последната служи като източник на амоняк азот.
Амонячен азот се въвежда в среда под формата на амониеви соли на различни киселини. Най-често това се използва за сулфат, хлорид, нитрат или амониев фосфат. Последно едновременно източник на фосфор (като се използва моно-, ди- или тринатриев фосфат, в зависимост от желаната реакционна среда).
Както фосфор източници в синтетичен носители обикновено се използва калиев фосфат или натриев фосфат. Предпочитание монозаместени соли на фосфорна киселина, по-кисела. В някои случаи, обаче, също се използва двойно заместени сол. Понякога да се получи желаният моно заместен реакционната среда чрез добавяне на сол в смесена среда с половин дизаместен. Като източник на фосфор, и понякога се използва амониев фосфат (едноосновен повече), които са едновременно и източник на азот.
серни източници в синтетичен носители обикновено са соли на сярна киселина, обикновено магнезиев сулфат, магнезиев източници - сулфат или магнезиев хлорид. Като източници на калиев фосфат се използва най-често (обикновено еднократно) или калиев хлорид.
Както се вижда от изложеното по-горе, в състава на всеки синтетична среда трябва да бъде основни химически елементи, въглерод, азот, фосфор, сяра, калий и магнезий. Въпреки това, за нормалната доставка на гъби често са необходими и други химични елементи, но и в най-малки количества. Този така наречен микроелементи. Доказано е, че нормалната черно оцветяване Спори от гъби Aspergillus Нигер офлайн, ако няма мед в средата. За да се формира този цвят в културата, трябва да минат няколко микрограма мед на литър среда. Въпреки това, конвенционални синтетични носители, в който съставът на медно съединение самостоятелно не правят това гъбички развива, образувайки черен конидии. Това се дължи на факта, че при получаването на медии трудно да се получи напълно чисти химични съединения, освен тези съединения обикновено са направени и редица следи от химикали, които не са безразличен за нормалното развитие на гъбичките.
Съществено значение е качеството на стъклото и изделия от стъкло, които се отглеждат в култура на гъбички. Редица съединения могат да се излугва в средата на стъклото. В това отношение, по-специално алкални различни видове стъкло, което в зависимост от средата за буфериране може да допринесе повече или по-малко бързото му алкализиране. "Pyrex" Ето защо, за прибори изследователски употреба, изработени от неутрално стъкло. За по-точни тестове са не само по-специално и внимателно се пречиства реагенти, но също по специален начин дестилирана няколко пъти с дестилирана вода и кварц изделия. Синтетичен среда в много по-голяма степен осигури сравними условия с репликация експерименти, отколкото неопределена среда.
Повечето синтетични носители, предложени за отглеждане на много видове чисти култури от плесени, има рН от 4,5 до 6,5. Киселинността в такъв диапазон е най-благоприятна.
Чапек сряда
Захароза 30 грама
Натриев нитрат 2 »
Калиев дихидроген фосфат 1 "
Магнезиев сулфат 0,5 "
Калиев хлорид. 0.5 "
Железен сулфат (черни) .. 0.01 "
Дестилирана вода до 1 литър ..
Агар 15-20 грама
Средата е най-често се използва за изследване на гъбички. Източник на въглерод - захароза може да бъде заменен в същите количества тегло на глицерин, глюкоза и други въглехидрати (рН 6-6,2) ако е необходимо да се въвеждат реакционната среда да се затвори в неутрално положение, а след това, вместо обичайните техники алкализирането често правят 0.5 г калиев дихидроген фосфат и 0.5 г динатриев хидроген на 1 литър среда.
Опростена сряда Rolen
Захароза 30 грама
Амониевият нитрат 2.5 "
Калиев дихидроген фосфат 1 "
Магнезиев сулфат 1 "
Железен сулфат (черни) 0.01 "
Агар .. 20 '
Дестилирана вода. 1 л
Целулоза сряда. Чисто филтърна хартия (най-добре е да вземе пепел без филтри), нарязани на ивици, сгъната, така че да се получи надлъжни гънки и лежи в тръбите. След това, те се прибавят с 2-3 мл течна среда или Чапек опростена среда без въглероден източник Rolin (минерална част), така че лентата хартия потопен в него в техните бази. След това се стерилизира при 15 ° С за 30 минути. Засяване гъби произвеждат на мокро хартията. Според растежа на активност върху филтърната хартия се оценява способността на гъбата разграждат целулоза. Понякога, като въглероден източник се използва в подобни случаи, хидрофилен.

Култивиране на гъби на слайдове
Култивиране на гъби върху изкуствени медии дава възможност да се старателно изучаване на тяхната морфология и физиология. Въпреки това, може да е необходимо да се извършва наблюдение на процесите на растеж и спорообразуването директно под микроскоп в изследването на морфологията на гъби по време на техния растеж. За тази цел, много видове сапрофитни гъби се култивират върху стъклени плочки.
Повърхността на чист слайд над калциниран пламък алкохол горелка и постави в хоризонтално положение (калцинирана страна надолу) във всяка позиция, така че да си почина на стъклото само от неговите краища. След това, в стерилна линия платина калцинира долната страна на стъклото се прилага една малка част от агар със стерилна среда. След това, в приложената фигура така среда стерилна игла или платина линия прилага мицелий или спори на изпитваните видове гъбички. След засяване вземат чисто парче покривно стъкло, калциниран горе алкохол пламъка на горелката, го оставете да се охлади малко и се полага върху слайда отдолу, държи парче от агар-агар. предметното стъкло може след това да бъде отстранена и покривното стъкло трябва внимателно да се изравни, така че агаровата среда се образува тънък слой. Стъклото на покритие трябва да се основава върху обекта, така че едната страна докосва близо до плъзгача и се намира във връзка с него под ъгъл от 10-15 °. За да се намали възможността от замърсяване на култура понякога е желателно да се излее стопените парафинови три съседни страни на стъклото на покритие, с изключение на една страна, най-отдалечен от повърхността на плъзгача. За да се избегне изсушаване среда получен "на живо състав" се поставя във влажна камера, така че страната най отворен култура обърната надолу, или с други думи, на върха на ъгъла, образуван от капака и слайд нагоре. Отглеждане на гъби върху предметно стъкло се извършва при желаната температура в пещ или в помещение. Наблюдения под микроскоп могат да се извършват по всяко време в периода между наблюдения на лекарства трябва да се съхраняват във влажна камера.

Получаване на лекарства за микроскопско изследване

Най-простият вид на препарати за микроскопско изследване на гъбички - е воден препарат. В чист стъклен слайд покритие капка чиста вода, и след това на върха на дисекционен игла или платина да го малко количество тестов материал и да обхваща чисти покривно стъкло. След тази обработка е готов за гледане под микроскоп. Въпреки това, тези лекарства имат значителни недостатъци. Водата е бързосъхнещ, и лекарството става неподходящ за гледане под микроскоп. Поради продължителното проучване на наркотици постоянно да се добавя вода под стъклото на капака. Освен това, водата бързо прекъсване на веригата от спори и спорангии разтваряне на черупката на повечето Mucorales видове, което прави трудно да микроскопско изследване. Тези недостатъци са до голяма степен лишени от препарати, в които се използва вода вместо смес от алкохол, глицерин и вода, взети в равни обеми. Този разтвор спори вериги разпадат бавно, отколкото във вода, и го препарати могат да се съхраняват в продължение на няколко седмици.
В някои случаи, за откриване на спори по вериги микроскоп трябва да бъдат формулирани по чист алкохол, добавянето под покритието стъкло като обект на сушене. За да се намали сушене на лекарството е препоръчително да го излее върху краищата на стъклото на покрива с парафин и вазелин да се запечата.
Лекарствата, които трябва да спести продължение на много месеци могат да бъдат получени в глицерин-желатин състав, както следва:
супер желатин 1 тегл.ч.
Глицерол chistyy7 тегл.ч.
Вода. 6 »»
Тимол или фенолни .. Следи
След загряване, глицерол-желатин образува хомогенна маса и се съхраняват в запечатан контейнер. Преди употреба, той се втечнява от топлина, а спадът се прилага върху предметно стъкло. След това, този спад е направена под формата на влажен тестов материал, плътно покрита с покритие стъкло с леко загряване и се изследват под микроскоп.
За откриване prorostkovyh след това чрез наблюдение на структурата на мембраните на спори и апарати спорообразуваща в гъбички е много удобен метод за накисване. Преди разглеждането микроскопски изследвани обект се поставя в силен спад на разтвора на калиев хидроксид върху предметно стъкло и се загрява почти до кипене над капака на лампата пламък дух и капак стъкло. Възможно е също така да се прилагат силен разтвор на хромова киселина, която се прилага капка под покривно водната форма.
Микроскопско изследване на безцветни обекти са много полезни за производството на оцветяване. При изготвяне на препаратите, използвани временен метод за така наречените жизнено оцветяване. За тази цел брой цветове: основният - тинтява-виолетово, метилен-Blau, шафранинов, Neutral-устата, Blau-анилин, метил виолет и други, от киселина еритрозин, портокал и др. Концентрацията на багрило в разтвора обикновено не трябва да надвишава 0.001-0.005%, а в някои случаи по-добре да се оцвети в концентрация от 0.01%. Интензитетът на оцветяване на клетъчната мембрана и зависи от съдържанието на боя и от проучване групата на гъбички. Общата позиция може да бъде, както следва: когато концентрацията на разтвора на багрило над определена оптимална оцветяване на обекта е твърде гъста и непрекъснато, което усложнява изследването, и при изключително ниска концентрация е достатъчна оцветяване разтвор. За да се разтвори бои, с изключение на водоразтворими мастила могат да се използват, например, млечна киселина (за анилин-Blau), глицерол (с метилен Blau) и други разтворители, петно ​​въпреки че в тези случаи не може да се счита живот.

От методите за изследвания за токсичност
Създаване на вида гъбички, които са токсични за хората и животните е от съществено значение за предотвратяване на отравяне. Ясно е, че трябва да се предхожда от изследване на свойствата на токсични вещества, произведени от тези гъбички, естеството на техните действия върху организма на животните, развитие на методите за изхвърляне и методи за лечение на отравяне.
Създаване на токсичността на някои видове гъби, и по-специално създаването на техния етиологичната роля в някои заболявания обикновено е трудна задача и изисква участието на съответните специалисти в различни области на биологични и медицински науки. Успешното решение на този проблем зависи от използваните методи в такива изследвания, които трябва да се вземат изцяло под внимание особено биология и пластичност на токсично видове гъбички и микроорганизми (или животно), естеството на заболяването и др. D.
Когато се изясни естеството на отравяне и за установяване на техните патогени методи и начини за решаване на проблема за всеки отделен случай може да варира. Ето защо, само общите съображения, изложени по-долу по отношение на методите за изпитване за токсичност гъби, които произтичат основно от проблеми микоцидна изследвания. Те включват три основни начини за определяне на токсичността на гъби: създаване субстрат токсичност изкуствено заразени гъбична култура в хранителна експерименти върху животни-възпроизвеждащи заболявания подобен комплекс от симптоми от естествен подбор otravleniyu- токсични метаболити изследване на тяхната химична природа и биологично действие.
В случая, когато пробата се детектира развитието на вече известни вида на токсичен гъбички токсичност трябва да се разгледа преди всичко гъбични видове, появяващи се на тези проби в повече или по-малко значителни количества. Прави и това, разбира се, много желателно да се проучи възможен брой проби, като понякога тип гъби (причинителят на болестта на човек или животно) може да бъде малко количество или дори да останат незабелязани. Допълнителна внимателен анализ на тези проби, използващи стърженето също трябва да бъде възможно да се използва повече от обикновено, при повторен анализ на метода на натрупване.
Изолирани в чисти култури от гъбичките след това се засаждат в точното количество. Въпросът за медиите за отглеждане на гъби, за да се получи материал за токсикологичните изследвания, е от съществено значение. Известно е, че условията на гъби храненето имат значително влияние върху образуването на токсични вещества. Най-подходяща среда за отглеждане на гъби в изследването на токсичните свойства на субстрат, предизвика отравяне на животните. За тази доста доброкачествена субстрат в автоклав и се инокулира с чиста култура на тест гъбички с подходящ влага. В някои случаи, гъбите могат да се отглеждат върху медиите неопределени, като жълт агар, брашно агар и така. Н.
Основната и решаваща изследователски метод гъби токсичност животното се да го хранят или губиш под-
прослойка. В експерименти на хранене са много важни и за установяване на дози от материал за хранене на животни, вида на животното, неговото състояние и съотношението на хранене.
Хранителни експерименти с лабораторни животни се провежда в две серии: а) остра, за еднократна употреба за хранене на субстрата, или впоследствие, заразени с гъбичката изолира от тях вещество, и б) хронично (продължително прилагане на малка емисия доза замърсени с токсични гъбички, или токсин). Това позволява на снимачната площадка характерните клинични и патологични признаци и стъпка поток храносмилателния mycotoxicosis.
За решаване на отделни проблеми в изследването за токсичност на изпитвания материал или гъбички могат да бъдат използвани и други методи: интравенозно, интраперитонеално, или подкожно приложение на животни екстракти на токсичен материал, покриването им на депилира (освободен от косата) кожата заек или лигавицата на окото. Тези техники могат да бъдат ценни при проверка на свойствата на гъбички токсичност на токсични вещества, които имат по-голяма или по-малка степен са известни. Ако свойства на тези вещества не са известни, в хранителна експерименти, тези методи без проверка на токсичността гъбички може да доведе до погрешни заключения. За парентерално приложение на животно или се прилага към лигавицата или друг око вещество може да има токсичен ефект, и когато се подава към някои от тях са безвредни и, следователно, не причиняват храносмилателния mycotoxicosis. От друга страна, когато изследване за токсичност броя кожна проба от гъбички на токсини, образувани от гъбички, не е значително действие върху кожата и в същото време може да предизвика отравяне на животните при хранене замърсени фуражи. Освен това, при прилагане на екстракти от изпитвания материал към кожата или лигавицата на заешки очи или чрез парентерално прилагане изисква тези екстракти не съдържа токсично вещество, образуван от гъбички.
Химична метод за определяне на токсичността на зърното (или други субстрати), болни Fusarium sporotrichiella, Olifson предложен. Тя се основава на взаимодействието на токсични стероли с основи, резорцинол и киселина фуксин. Пила от автора, отбеляза съвпадението по 82-85% с данни на биологична.
Пробата за изследване е първото екстрахира с 50% етанол, суши се до сухо, след това се екстрахира с етилов етер токсични липиди и стероли. Отстраняването на разтворителя остава масло, в което токсични вещества са качествено определени по следните методи.

1. Алкална реакция. Тя се основава на взаимодействието на стероли, съдържащи шестчленен лактон (kumalinovoe) пръстен с основи. Прибавянето на етер към разтвора в присъствието на алкални стероли екстракт причинява образуването на кафяви пръстени на границата между два слоя.
2. Резорцинол реакция. Въз основа на образуването на цветни кондензационни продукти на лактони с резорцинол в присъствие на концентрирана солна киселина. Характерно също за кумарин kumalina, ароматни алдехиди.
3. Реакция Либерман - Buharda да се определи стероли с двойни връзки.
4. Реакция с киселина фуксин в присъствието на малко количество амоняк. Ако има токсични стероли, алдехидни групи, образувани под действието на амоняк, дава червено.
5. флуоресцентен метод. Флуоресцентните алкални разтвори токсични стероли има жълто-зелен цвят (sporofuzarionenin, poefuzariogenin, stahibotriotoksiny).

Други специфични химични реакции за определяне на токсини наскоро използвани хроматографски метод. След предварително пречистване, веществото се хроматографира върху тънък слой, обикновено над силикагел при използване на някои системи от разтворители, Rf значение определи наличието на токсина. Хроматограмите са разработени с реагент, като цветна реакция с токсина, както и определяне на флуоресценцията в ултравиолетова светлина, или чрез използване bioavtograficheskim чувствителни тестови микроорганизми.
Последващото елуиране на петна открити в хроматограмата на съответните разтворители позволява количествено определяне на токсин.
Основно биологично изследване на наличие на афлатоксини, проведено на Патици еднодневни, които са намерили характерните поражения на черния дроб.
Методи за определяне на токсичността на фъстъци и нейните продукти са били обект на изследване, проведено в много лаборатории в Англия и други европейски страни и Съединените щати. Като цяло, те се редуцира до получаване на метанол или хлороформ екстракти от фъстъци или токсични продукти от това, отстраняване на разтворителя и втора екстракция с екстракт метанол токсин след това се хроматографира върху тънък слой от алуминиев оксид, като се използва разтворител от 1,5% метанол в хлороформ, силикагел, или с 5% метанол в хлороформ. В тези случаи, компоненти на афлатоксини В1, G1, В2, V2 се определят чрез флуоресценция в UV лъчи и съответната стойност на Rf, известен кристални лекарства, последвано от елуиране с отделни петна хроматограми произвеждат афлатоксин и кристални препарати.
За флуоресцентен анализ и надеждност на разлики афлатоксини от други флуоресцентни вещества в екстракти, използвани като тестове за потвърждаване на токсични фъстъци. Три предложен реакция с афлатоксин В1, въз основа на олефиновата връзка способността етер фенолни пръстени, за да реагира с хидроксилната група под влиянието на силна киселина (афлатоксин Bj съдържа енолов етер единица в фуран пръстен): а) тест с оцетна киселина и tionilhloridom- б) с мравчена trionilhloridom- киселина и в) с трихлороцетна киселина. След прибавяне на споменатата киселина към хлороформ разтвор на афлатоксин смес след отстраняване на разтворителя се хроматографира върху тънък слой от 5% метанол в хлороформ. В типичните случаи (.. Т.е. пробата и наличието на афлатоксин В1) продукти "и" реакция за образуване на две места на един и същ размер и с Rf стойности от порядъка на 0,50 и 0,43 (Rf чист афлатоксин - 0.50) - реакционни продукти " б "дава единично петно ​​с Rf, равна на около 0,18- реакционни продукти" с ", образуват две места: един подобен афлатоксин В1, различни от Rf, равни на около 0.20. Тези тестове могат да се използват за афлатоксин G1.
Количествено определяне на афлатоксини основава на измерване на абсорбцията на метанол елуати от хроматографски плочи (363 MMK 363 нм = 22000). Токсичен фъстъчено брашно първоначално petrolineynym екстрахира с етер, а след това - метанол (6Н) - метанол разтвор се разрежда с дестилирана вода и отново се екстрахира в хлороформ в продължение на 6 часа. концентрира Хлороформеният разтвор се хроматографира върху тънък слой от силикагел (750 микрона) като се използва диетилов етер като разтворител и 2% метанол в хлороформ. Екстракция с студен метанол само ясно флуоресцентен ленти или място, свободен от други флуоресцентни вещества. Количеството на токсин в метанолов елуат разтвор се определя чрез оптична плътност при 363 нм (практически 210-400 нм). Според авторите, чувствителността достига 0,001 микрограма. Той предлага много различни версии на този метод.