Моравото рогче paspalovaya - toksinobrazuyuschie микроскопични гъбички

Claviceps paspali Stev. et Hall.-ергот paspalovaya
Klavitsepspaspalitoksikoz (Clavicepspaspalitoxicosis)
Разпределени в Paspalum видове в тропическите и субтропическите страни. Отравяния възникнат двете животни на пасища, и по време на жилища, когато се хранят с сено склероции на гъбата. Такава отравяне настъпили, например, в Австралия, Нова Зеландия, Африка, Южна Америка, САЩ, Турция и др. В СССР, съобщено за първи път през 1942 г. на брега на Черно море на западния Грузия на Paspalum digiiaria и П. dilatatum.
При говеда, коне, магарета са наблюдавани заболяване, известно под името "Забрадка" (Magradze, 1948).
Според Salikova (1944), при коне отравяне се среща в по-тежки, отколкото при говеда и свине. В най-тежка форма се среща в недохранени животни и телета. Болните животни, възприемчиви към повторно заразяване. Заболяването се развива в 2-6 дни след началото на подаване на замърсен фураж (трева).
Токсичен акт вещества гъбички върху централната нервна система на животни. Първият признак на болестта - липса на координация. След това, конете показват мускулен тремор, депресия, и ограничаване на движение, тялото люлеещ назад и напред от външната страна. Крави са отбелязани временно слюноотделяне, нестабилност на походката, плахост, някои - разширени зеници, раздразнителност. Телесната температура остава нормална или падне под нормалното. Хиперемичната лигавица на устната кухина. Pulse слаб пълнене. Перисталтиката засили до известна степен. В зависимост от продължителността на заболяването (от 2-3 дни до 1-2 месеца или повече) животни тлъстина намалени, за да завършите изтощение. Намалена млеконадой. Но месото и млякото на заразени животни на хора са безвредни.
При аутопсия обикновено се намират местни фокални увреждания на стомашната лигавица, дегенеративни промени в сърдечния мускул и лимфната хиперплазия, особено мезентериалните, zhelez- на възпаление лигавицата на стомаха, има еритематозни области и в малки количества, петехиални кръвоизливи. По-изразен фокална хиперемия и фокална кръвоизливи в лигавицата на тънките черва. Лигавицата на дебелото черво и на сляпо черво фокална хиперемия и понякога хеморагичен възпаление. Има инжектиране на гръбначния и мозъчно-съдови и чернодробна паренхимни дегенерация.
След два или три дни след промяната на фуражни животни се възстанови.

Фиг. 13. Структурата на някои алкалоиди С /, Purpurea:
и - тетрациклични ядро ​​алкалоиди на моравото рогче, 6 - производни на лизергиновата киселина, - производни на clavine алкалоиди.
Превантивните мерки срещу болестта са в началото вентилационн сено да образуват конидии етап (sfatselii) и склероции, предотвратяване на хранене на заразените растения, унищожаване paspaluma (Paspalum) в храстите и м. P.
Ако отравяне CL paspali едър рогат добитък, коне, овце отбележи, че зрели склероции са по-малко токсични.
от млади, но е по-токсичен от гъбичката в етап sfatselii (Pido Plichko, 1953).
Много произведения, посветени на проучването на различни аспекти на биологията на моравото рогче и ерготизъм, гъбична екологията, чувствителността на различни сортове зърнени култури и на инфекция, условия на изкуствено заразяване, ефектът на различни условия за токсичността на склероции, химическата природа ergotoxine и сътр. Били са значителен напредък в изучаването на химия и фармакология ergotoxine През последните години както и метода на сапрофитни гъбички култура.
Понастоящем голям брой токсини описано алкалоиди на моравото рогче и техни производни, които притежават висока биологична активност и се използва широко в медицината. Ерго алкалоиди, представени с два основни вида: klavinalkaloidami, техни производни и пептидни алкалоиди, производни на лизергиновата киселина. Структурата на тези видове включват редица подобни, но различна структура и свойства на токсина (фиг. 13).
Алкалоиди тип Clavinova, като в основата на ерголин (argoklavin, elimoklavin и др.), Сравнително проста структура с молекулно тегло от около 250. В сапрофитни култура те са сравнително проста. По-сложно toksinogenez тип алкалоиди полипептид, имащ състав на лизергиновата и isolysergic киселина. Молекулното тегло на тези алкалоиди е около 600 те предимно са маркирани в мицел в /, Purpurea. Toksinogenez образуване и ергоалкалоиди на сапрофитни култура на повърхността и дълбоко култивиране методи са изследвани от много автори (Абе и сътр., 1953, 1955, 1961, Taber 1966-, 1957- Тейлър и сътр., 1960, и др.).
Neklavinovye алкалоиди, представени епимерни двойки - амидни производни на лизергиновата и isolysergic киселина. Притежават биологичната активност на производни на лизергиновата киселина.
Лизергиновата киселина съдържа хинолин и индол struktury- присъствие последната характеристика прави sinefioletovoe оцветяване разтвори с глиоксалова и концентрирана сярна киселина, която се използва в качествено и количествено определяне ergotal oidov изч.
Опростени амидни производни на лизергиновата киселина (ергометрин и ergometrinin) образуват серия от съединения, получени от полициклична пептидна верига (ерготамин и ergotaminin) - друга серия (Таблица 1.).
Понастоящем голям брой производни описано clavine алкалоиди лизергиновата и се изолира от склероции на сапрофитни култура или С /, paspali и С /, Purpurea, различаващи фармакологичен, токсични и други свойства. Така ergotoxine, ерготамин, ergozin действие върху гладката мускулатура, свиват зеницата, кръвоносните съдове, което води до недохранване тъкани (цианоза и гангрена), моторни парализира симпатикови нерви. Ергометрин до голяма степен намалява мускулите на матката, но по-малко токсични (не причинява гангрена).
Определяне на токсини, произведени по различни методи: фармакологични, химични реакции и оцветени с интензивност на флуоресценция, UV-спектрометрия и хроматография (Вайнинг, Taber, 1963).
Таблица 1
Кратко описание на някои алкалоиди Cl. пурпуреа

Получените щамове CZ |. Purpurea, образувайки паразитни и сапрофитни култури предимно clavine алкалоиди или алкалоиди лизергиновата киселина.
Вайнинг и Taber (Taber, Вайнинг, 1960) се изследва в сапрофитни култура ergotalkaloidobrazuyuschie щам свойства при 41 ° С /. Purpurea, извлечен от различни растения, Aspergillus flavus, Coniothyrium fuckelii, Ustilago bulata, U. trebouxii, U. майдис, плесен в тестото.
Трябва да се отбележи откриваеми количество ergotoxine щамове при 18 ° С /. Purpurea и образуване в P. roqueforti вещества подобни на Rf стойност elimoklavinom и penniklavinom argoklavinom. От източника на въглерод изследван най-подходящ за образуването на алкалоиди оказа галактоза смес с glyukozy- растеж не се наблюдава в средата с глюконат и дулцитол. Като източници на азот, амониев оказа по подходящ кехлибарена киселина, соево брашно, урея, екстракт от мая. В среда с калиев нитрат, карбамид и / -triptofanom като единствен източник на азот, не се наблюдава растеж на гъбички, но с прибавянето на 500 мг л / -tryptophan - среда с амониев сукцинат
ergotoxine продукция в 35-дневен култура почти се е удвоил. Не е имало гъбичен растеж върху среда, съдържаща винена, фосфорна, оцетна киселина, но с добър добив ergotoxine получен в среда, допълнена с янтарна киселина. Авторите установяват, че синтезът на съотношение въглеродни източници ergotoxine оказва значително влияние (галактоза) и фосфорен (таблица. 2).
Таблица 2
Ефект на съотношението галактоза и фосфор в образуването на алкалоиди мораво рогче

Въз основа на изследванията установен типична скорост на растеж гъбички и образуването на алкалоиди. Последният се появява, когато намаляването на основните компоненти на средата, и значителен период (20 дни), растеж на мицел (фиг. 14).

Фиг. 14. Растеж и образование ergotalkaloids мораво рогче в сапрофитни култура на среда с галактоза.
Щамове С /, Purpurea различават по способността за образуване на алкалоиди с растежна среда с различни захари и азотни източници. От 10 изследвани щамове образувани алкалоиди с растеж на среда с галактоза, 8 - на среда, съдържаща захароза и само един щам - в среда с лактоза.
Изследваните щамове също се различават в обхвата на използване на захар: един щам образува алкалоиди използват пет захари, трите - чрез използване на четири и т.н. Въпреки това, е отбелязано, пряката връзка между възможността да се използва захар и образуването на алкалоиди ... От пет щамове С /. Purpurea две алкалоиди са образувани по време на растежа на средата с амониев сукцинат, три - с растежа на средата с дрождев екстракт и никой - когато се отглежда в среда с аспарагин.
Отбелязва, различните щамове на C активност /, Purpurea и влиянието на околната среда върху общия добив и състав ergotoxine. Добавянето на тиамин и цистеин леко увеличава общия добив на алкалоиди. Благоприятни условия за растеж на мицел, не винаги води до биосинтеза на токсини (Voigt, Keipert, 1967). има значителен
Инхибирането на биосинтезата на токсини в деутерий атмосфера (Mrtek и сътр., 1967).
Tayberg Vaning и показа промени в компонентите на мицел в /. Purpurea, появяващи се по време на периода на растеж, във връзка с образуването на ergotalkaloids зависимост от различни концентрации на фосфат в средата, азотни източници и адаптиране на метода на инокулум за използване галактоза (Taber, Вайнинг, 1963).
Тези резултати предполагат, че интензитетът на мицел растеж не е общ фактор за регулиране образуването ergotalkaloids. Културите мицела преди образуването на токсини натрупани полиоли, въглехидрати, липиди и остава висока концентрация на водоразтворим азот и РНК.
растеж Амплификация мицел при висока концентрация на фосфат в средата не се съпровожда от увеличаване на образуването ergotalkaloidov- високо съдържание на общ азот записва когато се отглежда в среда с ниска концентрация на фосфат. натрупване РНК и водоразтворим азота е най-характерно образуването на индекса ergotalkaloids.
Въз основа на това, авторите смятат, че образуването на ergotalkaloids се случва по време на преходната фаза на растеж, характеризиращ се с продължаване на натрупване азот, но не запазват въглехидратни вещества. В хроматографско изследване на захари и полиоли мицел С /. Purpurea установено, че основните и резервните компоненти на неговата постоянна са трехалоза и манитол, присъствието на други въглехидрати (глюкоза, арабитол, глицерол, дулцитол) зависи от състава на хранителната среда за култивиране на гъбички (фиг. 15).
Това показа значителен ефект на неорганични компоненти на средата - на различни минерални соли и микроелементи - растеж и образуването на алкалоиди лизергиновата номер (Rosarra и др, 1967)..
Авторите използват щамове на Claviceps paspali, образувайки лизергиновата киселина и нейните производни. По-специално, има значителен ефект на минералния състав на чешмяна вода до образуването на алкалоиди, във връзка с което се препоръчва от специален състав на минерални соли среда стимулира синтеза на алкалоиди лизергиновата киселина.
Авторите са избрани щам на С /. paspali, който чрез култивиране на гъбата в тези среди, образувани от повече от 1000 мкг алкалоиди на 1 мл среда.
В първия етап на растеж на гъбичката се култивира в алкална среда с 4% манитол, 1% янтарна киселина и микроелементи, във втория - на среда, съдържаща 5% манитол и 3% янтарна киселина. В третия етап се определя чрез растеж и образуване на алкалоиди в зависимост от наличието на определени минерални соли и микроелементи: Са (N03) 2 - * H2OJ (л, 27 • 10-3), MgS04 • 7Н20 (3,25 х X kg3), ZnS04 • 7Н20 (1,74 • KG5), FeS04 7Н20 • (1-80 • 1 (Т4), CuS04 • 5H20 (2,01 • 1 (Р5), MnS04 • 4х20 (4,48 • 10-5), наночастици,
(1,19 • 10-3), KH2P04 (7,35 • 10 3) в мола на литър. Установено е, че за щам С /, paspali нужда калий и магнезий за растеж мицел е същата, както в alkaloidoobrazovanii.

Фиг. 15. Състав Промяна ендогенните захари и полиоли в мицела
Мораво рогче, в зависимост от състава на хранителната среда:
и - глюкоза и амониев сукцинат, б - галактоза и амониев сукцинат, D-маноза и сукцинат амониев г манитол и амониев сукцинат.
Максимален растеж се наблюдава при по-ниски концентрации на фосфор, желязо, цинк, отколкото в образуването на алкалоиди. Манган и мед значително да повлияе на синтеза на алкалоиди (фиг. 16).
Shalagina и сътрудници (1965) са изследвали образуването на алкалоиди в 32 щамове С /. Purpurea, изолиран от склероции треви, пшеница, ръж в различни географски региони на СССР. Гъбичките се култивират в повърхностна култура в среда със следния състав: захароза - 75 Сорбитол - 25, амониев цитрат - 5, KH2P04 - 0.25, Са (ON3) 2 - 1.5, MgS04 - 0.25 (в г л!) , KS1 - 0125, ZnS04 - H20 - 0,00003, FeS04. 7H20 - 0,03, цистеин - 0.01, аневрин - 0.0001, биотин - 0,000001 (рН 6,5). Наличието на токсини в мицела се определя в половин до два месеца на културата. Повечето щамове изследвани при тези условия и формира ергокриптин ergotamin- последният е преобладаващо, възлиза на 80% от общия добив на алкалоиди.

Фиг. 16. Ефектът на микроелементи на мицел растеж и образуването на ergotalkaloids в сапрофитни култура от Claviceps paspali:
и - калий, б - фосфор - магнезий, г - сяра, г - желязо, д - цинк, w - манган
ч - меден (1 - мицел, 2 - алкалоиди на моравото рогче).
Общият им съдържание равно на около 0.03% на базата на сухото тегло на мицел (таблица. 3).
таблица 3
Състав алкалоиди, образувани от различни щамове на CL Purpurea

Castagnoli и Mantle (Costaghnoli, Mantle, 1966) изследва алкалоид структура, образувана в сапрофитни култура щамове С /, Purpurea, изолирани от различни треви. Показано е, че щам, изолиран от Spartina townsendii при рН 8,5 се екстрахира с хлороформ от филтрата 40% токсини остатъка на - бутанол при рН 3,5. Хроматография на екстракта от хлороформ на хартия, и тънък слой от силикагел в голямо количество се получава и малка henoklavin - elimoklavin и ergotoxine. Хроматография на п-бутанол екстракти автори са открили, че щам г-лизергинова киселина и негов изомер 6-metilergol-8-трудно-8-карбоксилна киселина. г-лизергинова киселина в малко количество е предварително изолирани от филтратите на щамове С /, Purpurea, изолирани от Pennisetum typhoideum.
Kostanoli и Tonoli (1966) изследват образуването на ergotalkaloids CL Purpurea и С /, paspali в потопена култура. Той установява, че в настъпва синтез сапрофитни култура ergotalkaloids в спорогенните щамове (които не са конидии). В alkaloidobrazuyuschih активни щамове, особено в Потопени култура, хифи от характера на растеж и функционална активност има няколко фази. Фаза, характеризиращ се с наличието на типичната структура sklerotsialnoy мицел кратко удебелени клетки и изобилие включвания мазнини, е свързано с образуването на ergotalkaloids.
Когато култивирани щамове С /, Purpurea и CL paspali на пептон-манитол среда, отбелязани петкратно увеличи с увеличаване на освобождаване токсин от концентрация 5 до 25% захар.
Отглеждане на клетката и безклетъчни екстракти проучен щам CL Purpurea в сапрофитни култура съдържа ензими, които носят различни пътеки глюкозния метаболизъм. Когато се отглеждат в потопена култура на захароза-минерална среда или среда с карбамид и дрожден екстракт в не-клетъчни структури показват, хексокиназа, глюкоза-б-фосфат дехидрогеназа, 6-phosphogluconic киселина алдолаза ензими на пентоза цикъл (Me Доналд и сътр., 1960). Намерено рентгенографски относителната важност на различните пътища на глюкозния метаболизъм в гъбички: 90% глюкоза отглеждане клетки, трансформирани в резултат на гликолиза и цикъла на Кребс, 10% глюкоза се усвояват от pentozo- цикъл фосфат. Ензимните пътя унищожаване алкалоиди изследвани чрез окисление на пероксидаза от хрян (Taylor, Shough, 1967), декарбоксилиране белязан триптофан и неговите производни в молекула argoklavina и alimoklavina (Plieninger и др, 1967.) - идентифицира специфична реакция ензимно хидроксилиране в много видове гъбички (Beliveau, Ramstad, 1966 и др., Orange, Гончаров, Bezborodov, 1969).
Определете различни нужда гъбички фосфати за максимален растеж на мицел и образуване ergotalkaloids. В процеса на растеж на съдържанието на гъбички ортофосфат на течност култура е значително намален, намалява образуването на разтворим в киселина, киселина неразтворими полифосфат и използва първия във връзка с увеличаване на съдържанието на РНК (раздел. 4).
ТАБЛИЦА 4
фосфат съотношение време Claviceps растеж Purpurea

* Като процент на екзогенен Р04 KH2P04.

Както се вижда от таблица. 4, 35-дневна култура CL Purpurea при максималната образуването на ergotalkaloids значителна част от екзогенен фосфат, използван за образуване на РНК. Смята се, че съотношението на образуване на нивото и количеството на киселина неразтворим РНК полифосфати типични toksinobrazuyuschego щам С /, Purpurea. Ефектът на пуринови производни и енергийни фосфати в синтеза на РНК, и образуването на ergotalkaloids съдържание фосфат (Waart, 1960, 1961).
Редица схеми биосинтеза clavine алкалоиди лизергиновата киселина и алкалоиди. В експерименти с белязан показан-триптофан po94 че е прекурсор на лизергиновата киселина. Грегер (Грьогер и сътр., 1961, 1964, 1966) показа, че триптофан е предшественик на clavine алкалоиди от klavinobrazuyuschih щамове CL Purpurea в сапрофитни култура. Последователността на тяхната биосинтеза следва схемата: триптофан elimoklavin henoklavin -> agroklavin elimoklavin производни на лизергиновата киселина.
Remsted и Taylor (Taylor, Ramstad, 1960) откриват, че прекурсорът на мевалонова киселина е изо-изо-пентенил част на лизергиновата киселина.
Plininger (Plieninger, 1965) счита, че ergotoxine на биосинтеза провежда както следва: agroklavin elimoklavin лизергиновата киселина -> алкалоиди на моравото рогче.
Kostanoli и Mantle (Costahgnoli, Mantle, 1966) изследва биосинтетичен път страничната верига karbinolamidnoy - oksietilamida лизергиновата киселина със структурна прилика на пептид страничните вериги на тип алкалоид ерготамин. В експериментите авторите алкалоид превръща чрез пиролиза на ацеталдехид и лизергиновата киселина амид Показано е, че много от веществата в алкалоид молекулата, само аланин и пируват до голяма степен включен в страничната верига (таблица. 5).
Таблица 5
Включване на радиоактивни вещества в молекулата на-лизергинова киселина oksietilamida

Mayer, Kiba и Komersova (Mayer, Kybal, Komersova, 1967) изследва ерготамин ergotoksinobrazuyuschie щамове и гъбички. Когато техния растеж върху среда, съдържаща белязан аланин в хидролизати ergotoxine значителна част от радиоактивността, съдържаща се в валин и левцин. Означени метионин не е включена в някоя от структурните звена на пептидната верига. Възможните начини за синтез на пептидни вериги.