Aspergillotoksikozy - toksinobrazuyuschie микроскопични гъбички

Aspergillus Mich. - Aspergillus aspergillotoksikozy (aspergillotoxicoses)
Aspergillotoksikozy хората и селскостопанските животни са широко разпространени в много страни по света. Има многобройни съобщения за поява на ензоотична aspergillotoksikozov в САЩ, Франция, Англия, Полша, Норвегия, Италия, Индия, Аржентина, Нова Зеландия и други страни. Aspergillotoksikozy маркирани в СССР.
Замърсяване на храна и промишлено суров Aspergillus - А. fumigatus, A. flavus, А.нигер, A. clavatus и др причиняващи аспергилоза човешко заболяване и aspergillotoksikozom. По-често в лабораторни работници, зърно асансьори и складове, solodovschiki пивоварни, дестилационни инсталации и други заводи, работници са кравефермите и т.н. Много видове Aspergillus описани като патогени и бронхо dermomikozov хора и животни. През последните години, аспергилоза маркирани като вторични инфекции след антибиотична терапия (Austwick, 1965).
Токсичността и патогенността на някои видове Aspergillus, засягащи фуражи и храни, не са добре разбрани, и toksinobrazovaniya връзка и паразитизъм в тялото на животно, което не е ясно. Известно е, че обикновено се появяват при разхлабване аспергилоза тъкани и се влияе от други фактори. Един би си мислите, че образуването на токсични метаболити е от значение за развитието на аспергилоза. Сред най-добре изучени отнася aspergilloflavotoksikoz (афлатоксикоза) през последните години. Многобройни данни на местни и чуждестранни автори предполагат, че A. flavus е един от доминиращите видове гъбички, които заразяват царевица, фураж, фуражи и други видове концентрати (победят тези субстрати до 40-100%).
Oustuik (Austwick, 1965) класифицира болестта на топлина и студенокръвни животни, причинени от вида Aspergillus, в три групи:

1. Микоза (аспергилоза). Характеризира се с лезии на живи тъкани от различни органи от: а) първична инфекция - въвеждане на патоген (гъбични клетки) в здрава тъкан, сензорът organa- б) вторична инфекция - въвеждане на гъбата в тъканите, засегнати от туберкулоза, хистоплазмоза, карцином и т.н., след травми .. усложнения след антибиотик и кортикостероидна терапия или тъкан отслабена от влиянието на други фактори.
2. Алергия. Това произтича от вдишване на конидии или друг контакт с гъбата. Той проявява като сенна хрема, конюнктивит, дерматит, бронхиална астма понякога.
3. Aspergillotoksikozy. Това се случва, след излагане на токсични метаболити, образувани в храни или фуражи, засегнати от гъбички.

Микоза и алергични заболявания възникват главно дихателните маршрут, mycotoxicosis - на заболявания, които възникват главно храносмилателния път.

Aspergillus flavus Link - Aspergillus жълто

Aspergilloflavotoksikoz, афлатоксикоза (Aspergilloflavotoxicosis,
афлатоксикоза)

Той причинява заболяване на младите птици и други животни.
Mushroom токсичност за животни, създаден първият Шайло (1940). Проучване на ефекта на организъм Aspergillus зайци и плъхове автор показа, че екстракти от фуража заразен с гъбички (30-дневна култура), както и от гъбична култура отглеждат в среда Rolin, имат токсичен ефект. Когато се прилага на животните интраперитонеално изход е летална, в зависимост от дозата и времето vvedeniya- когато перорално приложената доза два пъти интраперитонеално, там е ясно изразен токсичен ефект, но без смърт. Известният автор и водолазите токсичност на екстракти от храна за животни, заразени с A. flavus, и култура на гъбичките.
Levitsky и Konyukov също наблюдава токсичност на щамове A. flavus (1947). Kulik (1957) намерено токсичния ефект на гъбата и засегнатите хранителни ги грах. Авторът показва, че токсични свойства са свободни и свързаните липиди грах заразен с гъбички. Те действат върху krolika- конюнктивата, когато се прилага орално котка появи повръщане, диария, остър leykotsitoz- летална доза на свободен липид е свързан 9-11 - 8-9 г / кг. Мастни киселини фракция по-токсични, летална доза от 4.5-5 г / кг когато се прилага на животни, показа признаци на по-малки дози, изразени отравяне.

Инсталиран индивидуална токсичност щамове A. flavus, изолиран от мухлясала храна, която причинява болест по свинете в САЩ (Burnside и сътр., 1957- Forgacs, Carll, 1962).
Допълнително проучване на токсичните свойства на A. flavus е свързано с изследването на болести на младите птици (пуйки). През 1960 г., в птицеферми в Англия, убивайки около 100 000 пуйки. Намерени са мъртви животни, остра чернодробна некроза, свързани с пролиферация на епителни клетки на жлъчните пътища. В началото тя е направена предположения за токсичните ефекти на алкалоиди ragwort. Тогава стана ясно, че болестта е причинена от пуйчета и патета хранене фъстъчено брашно, внесени от Бразилия. При хранене седмици млади мъжки и женски плъхове на диета, съдържаща 20% фъстъчено брашно токсичен при животни появи забавяне на растежа, намалява смилаемост и с вече хранене - тежко чернодробно увреждане. При аутопсия плъхове проучването бяха убити след 9 седмици след тази диета, беше отбелязано, че черният дроб е набръчкана, с многобройни subkapsul Яр ПРАВИТЕЛСТВЕНИ жълти фокусни porazheniyami- плъхове бяха убити след 30 седмици, черния дроб, ненормално повишено (на тегло два пъти тази на контролата животни), жълто-кафяв цвят, с неправилна нодуларно повърхност с червени, зеленикави жълтеникави кисти и множество фокални лезии. След шест месеца на хранене в 9 от 11 плъхове разкрива множество тумори на черния дроб, два - с белодробни метастази. Така се установи, че токсични фъстъчено брашно при продължително хранене на канцерогени на плъхове (Sargeant и сътр., 1961).
От токсични брашно екстракти, получени кристално вещество, което, когато се прилага перорално в доза от 20 мкг причинени смърт ден патета след 24 часа. Когато хартиена хроматография в п-бутанол и 5% оцетна киселина, дава единично петно ​​с Rf 0,7 и синьо флуоресценция при ултравиолетова светлина. Екстрактът от хлороформ от културалната течност A. flavus относно среда Чапек, или с растеж на нетоксичен стерилни грах хроматография образува аналогичен размазване на хартия. Полученият материал има токсични свойства, беше наречен афлатоксин.
Несбит и сътрудници (Несбит и сътр., 1962) провежда допълнително пречистване афлатоксин. Когато колонна хроматография върху алуминиев оксид в хлороформ: метанол (98,5: 1,5), получен две места в ултравиолетови лъчи. Един от тях с Rf 0.6 и виолетово-синя флуоресценция второ място афлатоксин В с по-ниска стойност Rf, и зелен флуоресцентен, наречен афлатоксин G.
Токсични метаболити, получени по време на инфекция от гъбички стерилни грахови зърна и култивиране на Чапек - Докс допълнена с ZnS04. След 5-7 дни след инфекция токсини екстрахира с горещ метанол, концентрирани екстракти се разреждат с вода и след това обезмаслени етил 40-60 ° петролев етер. След отстраняване на метанол токсин многократно се екстрахира с хлороформ. Хлороформеният разтвор се пропуска през колона флуоресцентен silikagelya- в ултравиолетова светлина фракция се изпарява до сухо и остатъкът се прекристализира от бензол или метанол. От кристал токсин културалната течност, получена чрез директно екстракция с хлороформ и последваща хроматография върху силика гел.
Сместа се поставя в апарата токсини противотоков система разделяне хлороформ - тетрахлорметан - вода - метанол (2: 2.5: 1: 3). Точка на топене афлатоксин В (с разлагане) от около 270 ° С, с молекулно тегло от 312-314, елементарен състав S17N1206. спектрите на поглъщане в ултравиолетовата светлина - максимум 223, 265, 363 пМ, в инфрачервения - 1755 и 1688 см-1. Оптичното въртене в хлороформ разтвор на афлатоксин = -562 ± 15 / с = 0.115. LD50 за еднодневни патета - по-малко от 20 микрограма.
Q1 афлатоксин в кристална форма, получена чрез повторно кристализация. Точка на топене 247-250 ° С, молекулно тегло 326-328, елементарен състав S17N1207 абсорбционен максимум в ултравиолетовата при 265,363 пМ, в инфрачервения DR-
Chah - 1125-1140 cm-3 [вд] = - 533 ± 5 (р = 0.133). LD50
патета ден е около 60 микрограма.
. (. Чанг и др, 1963) Cheng и сътр установено присъствието на втори токсично вещество - афлатоксин В2, и разрешаване на синя флуоресценция при ултравиолетова светлина, но са по-малко токсични. Когато култивиране на щам на A. flavus aflatoksinobrazuyuschego на стерилизира добив на зърно от пшеница афлатоксин В2 относително голям. Авторите смятат, че В2 е дихидро-афлатоксин В1 с точка на топене 286-289 ° С (разлагане) - максимална абсорбция в ултравиолетовия спектър - 222, 265, 362 пМ, в инфрачервения - 1760, 1685, 1625, 1600 см-1.
Karnagen, Hartley и Ocellus (Carnaghan, Hartley, Okeolly, 1963) се извършва сравнително изследване на токсичността и други свойства на флуоресценция на афлатоксини В1, В2, G1, G2. LD50 за ден патета афлатоксини В1 - 18.2 В2 - 84.8, G1 - 39 и G2- 172,5 д, т.е. възстановяване на изолиран терминал двойна връзка в пръстен digidrofuranovom афлатоксин В1 и G1, за да образуват В1 и G2 .. намалява тяхната токсичност малко повече от четири пъти (В2 - в 4.66 пъти в сравнение с В1, G2 - 4.4 пъти в сравнение с G1).
химичната природа и структура на афлатоксини В1 и G1 проучен на
Acao (Asao и сътр., 1963, 1965) и други автори (карданния и сътр., 1962- Чанг и др., 1963- Cheung, Sim, 1964). Тези съединения са получени от дихидрофуран (фиг. 18). Части В2 и G2 представлява gidroproizvodnye В1 и афлатоксин G1 съответно на двойната връзка в терминал digidrofuranovom пръстен.

Фиг. 18. Структура и токсичност на различни афлатоксини.

В редица последващи проучвания са изследвани щамове на A. flavus образуване на токсин от различен произход. Дейвис и колеги (Davis, Diener, Eldridge, 1966) показват, че образуването на афлатоксин активност и отделните компоненти в различни щамове не са идентични (таблица. 10). В експериментите авторите на гъби, култивирани в среда, съдържаща захароза (20%) и екстракт от мая (2%) в стационарна култура. В рамките на 6-8 дни, токсинът се екстрахира от културалната среда с хлороформ и се хроматографира върху тънък слой от силикагел (разтворител - 2.5% метанол в хлороформ). Активността се определя визуално чрез флуоресцентна интензивност в ултравиолетовия сравнение със стандартния габарит. Показано е, че щамовете, изолирани не само от фъстъци, но от царевица, зърна от други зърнени храни и фуражи, когато се култивират в синтетична среда и грах имат различна активност на афлатоксини. Маркирано изобилен растеж и образуване на гъбички активни афлатоксини (10-100 мкг / мл) върху носителя на въглехидрати с органичен източник на азот.
Културата на други видове Aspergillus, изолирани от фъстъчено (A. amstelodani, A. chevalieri, A. Ruber, A. terreus, A. restrictus,
А. Candidum, A. microviridocitreus) и Penicillium citrinum бяха практически нетоксични за патици. Когато ги хранят в продължение на три седмици безмаслен твърди вещества на филтрата значителна загуба на тегло се наблюдават в същото време, когато се хранят на същия продукт от филтрата на A. flavus животни значително загубиха тегло и умря на четвъртата - седмия ден. В проучването показа, характерни патологични изменения на органи.
Таблица 10 Получаване на афлатоксини различни щамове на A. flavus

Така, тези данни показват, че афлатоксините са някои от типичните метаболити на A. flavus.
Shotwell и сътр. (Shotwell и сътр., 1966) изследва образуването на активен афлатоксини A. flavus щам, когато се култивира върху стерилни ориз зърно. След екстрахиране с хлороформ заразен зърно сурови препарати афлатоксин утаява с хексан, колонна хроматография върху силикагел, пречистени компоненти - тънкослойна хроматография върху силикагел. Обучението автори A. flavus щам преимуществено оформен афлатоксин В1, максималният размер на което записа на петия ден растежа на гъбички и остана при високи нива до 12 дневна възраст. Максималното съдържание на афлатоксин G1 chetvertyy- отбележи само на петия ден на култивиране на гъбички (таблица. 11). Добив на суров токсин осем ферментации (в милиграми на грам субстрат) е: 1,0- 0,16- 0,8- 1,11- 1,1- 0,74- 1,19- 0,88. Съотношението на компонентите В1, В2, G1, G2 е 1.0: 0.15: 0.22: 0.02 .., т.е. средният добив суров токсин е 1 мг на 1 грам на зърно с преобладаващо образуване на афлатоксин В1.
Schroeder (Schroeder, 1966) показа, че екстракт от царевица мицел стимулира растежа и образуването на афлатоксини A. flavus (фиг. 19). Общо образуване афлатоксин на Чапек увеличава пропорционално увеличаване на концентрацията на царевичен мацерат: toksinobrazovaniya максимално съвпада с максимален растеж на мицел гъбички, но след намаляване на съдържанието токсин наблюдава по-бързо от лизиране на мицела.
Таблица 11
Образование за афлатоксини, Aspergillus flavus, когато се култивира върху ориз зърно

Krogh и сътр. (Krogh и сътр., 1966) изследва образуването на афлатоксини в осем щамове L. flavus, изолира от суровата и концентриран фураж се наричат ​​в Дания mikotoksikozopodobnye заболявания на различни селскостопански животни (крави, телета, прасета, коне).

Фиг. 19. Ефект на продължителност култура (а) и концентрацията на царевичен мацерат (б) афлатоксини образуване дейност
Aspergillus flavus на Чапек.
Авторите показват, че изследваните щамове на A. flavus при отглеждане на ръж и ечемик образува комплекс aflatoksinopodobnyh вещества, повече или по-малко ясно ви
е хроматография върху почти не дават положителен токсичен ефект при експерименти с патета.
От осемте щамове изследвани само три-токсични, по-слабо изразени в сравнение с референтната образуване афлатоксин щам на британски произход. Не е установена връзка между антибиотик и токсични свойства на изследваните култури.

Таблица 12
Образуването на афлатоксини и щамове коджикова киселина на различни видове Aspergillus и Penicllliutn

Сравнителен анализ на образуването на афлатоксин коджикова киселина и различни щамове на Aspergillus и Penicillium видове Parrish и сътр. (Parrish и сътр., 1966) също така, че образуването на афлатоксин характеристика главно за култури A. flavus, A. parasiticus, докато коджикова киселина намерени във всички изследвани щамове на A. flavus (92 от 93) и някои щамове на други видове Aspergillus и Penicillium (таблица. 12). Гъбичките се култивират върху глюкоза-ammiachnonitratnoy mikroelementami- среда разделяне с коджикова киселина и афлатоксини в екстракт от хлороформ се извършва чрез хроматография върху силикагел с бензол-оцетна киселина - вода (3: 1: 1).
Nyredi и Bondar (Nyirody, Bondar, 1966), изследването на микрофлората на храна над 300 проби установено, че 118 от тези удари A. flavus. Когато култивиране на изолирани култури от щамовете 64 споменато активно образуване на афлатоксин.
Раби и Smalley (Rabie, Smalley, 1965) откриват, че оптималната температура за растежа на A. flavus (в експерименти, 18 ° С) не съвпада с оптимална температура за образуване на афлатоксини (24 ° С).

Shayndler и сътр. (Shindler, Palmer, Eisenberg, 1967) изследват ефекта на температура (от 2 до 52 ° С) върху растежа и афлатоксин образуване В2 на два изолата на A. flavus. се наблюдава при 24 ° С (в рамките на същия период) образуването афлатоксин при температура под 18 ° С и над 35 ° С се наблюдава в продължение на 12 седмици - Максимален мицел растеж се наблюдава на петия ден при 29 и 35 ° С, максимална образуване на афлатоксин афлатоксин изолати от A. flavus, отглеждане при температура от 2,7 и 41 ° с, както изолати, които растат при 13 ° с, образува афлатоксин три седмици. Авторите идентифицирани с различен цвят хлороформени екстракти от течност култура изолати отглеждане на неравни температури и неговата връзка с активността на афлатоксини. В зависимост от температурата на връзката щам и култура между образуването на отделните компоненти на афлатоксин В1 и G1 промени.
Augustinavichyus (1965-1967), установен токсичност 16 щамове на A. flavus, изолирани от фуража в Lithuania, както и на почвата, зърнени култури в различни географски области СССР. При провеждането на кожна проба и протозои голямото токсичността проявява чрез култивиране на гъбата в стерилни грах, Чапек - Докс с цинков сулфат. Веществата елуират от зони етер, хлороформ и други екстракти, даващи синьо-синьо флуоресценция с Rf 0,5-0,7, притежават токсични и dermonecrotic ефекти. A. flavus щамове също предизвикват характерни патологични изменения на органи, главно белите дробове и черния дроб. В зависимост от щама свойства на заболяването се види с по-изразени признаци или flavoaspergilloza aspergilloflavotoksikoza.
Японски автори са изследвали образуването на афлатоксин 214 Aspergillus щамове с различен произход и продължителност на култивиране. Наличието на токсина се определя чрез флуоресценция плътна среда (обратната страна на колонията от гъбички), флуорометричен и чрез тънкослойна хроматография в силикагел на екстракти от култура течност. Отбелязано е, че има много други не вещества идентичен афлатоксин и няколко щама на единична образуване афлатоксин (Muracami, Такасе, Ishii, 1967).
Както вече бе споменато, един от най-важните биологични свойства афлатоксини канцерогенно действие се проявява в ниска доза на токсина в хронични експерименти (Lancaster, Genkins, Philp, 1961). При плъхове след 30 седмици на съдържание на диета с 20% фъстъци инфектирани A. flavus, черния дроб претеглени два пъти повече от нормалното, имаше кафяво-жълт неправилна, буци повърхност, червени и жълти зеленикави кисти и множество фокални лезии. Възлите на черния дроб туморът е гъсти жълтеникави хепатомни резени, пълни с кръв и жлъчна tsisty- са отбелязани жълти целенасочени лезии в по-ранен период. На бъбречни гломерули обвивка, запълнена с хомогенна еозинофилни massoy- подутини се състои от продълговати клетки с големи ядра и изобилен vazikulyarnymi вакуолен цитоплазмата. В някои животни на участъци на белите дробове разкри инфилтрация с анапластичен хематом клетки, митоза, както и други промени. Наличието на тумори в черния дроб при липса на цироза, некроза на клетки или клетъчна инфилтрация възможно да се предположи, че токсинът действа директно върху клетките.
Карнахан (Carnaghan, 1965) изследва канцерогенно въздействие на храна замърсени с A. flavus, за патиците, които са най-чувствителните към афлатоксин. В експерименти ние изследвахме седем дни патета съдържат в нормална диета, допълнена с 0.5% фъстъчено брашно токсични (около 7 мкг афлатоксин В1). 14 месеца след началото на храненето в 8 от 11-те птици са открити тумори на черния дроб.
Под влияние на афлатоксин В1 и G1 в бели мишки разработен първични тумори не само в черния дроб, но и в мезентериума, стомаха, белия дроб, устната кухина и слюнчените жлези, морфологично определя като саркома и фибросарком. Създадена под влиянието на афлатоксини инокулиране на тумора се утвърди в другите животни (Barnes, Бътлър, 1964- Newborne, Carlton, Wogan, 1964).
Образование хепатом в пъстърва наблюдава, когато я подава в продължение на 6-7 месеца суров подготовка на афлатоксин, произведени от пшеница, заразени с A. flavus. Когато се прилага в диетата В1 или афлатоксин G2 чист стана след 10-15 дни на острата летална токсикоза (Ashley, Halver, Wogan, 1964- Ashley и сътр., 1965). Young сьомга са 10 пъти по-устойчива. Много видове понасят високи дози афлатоксин във фуражите (Halver, 1965).
Карцином на панкреаса при плъхове държат на диета с афлатоксин (Barnes, Butler, 1964). Някои автори посочват, че за интрамурални плъхове инжектиране канцерогенни полициклични въглеводороди с леко увреждане карцином, но орално приложение на тези вещества резултат е отрицателен. Когато се прилага орално други канцерогенни вещества (N, N, 1, 2,7-флуоренил-бис-ацетамид, N-нитрозо-metiluretana 1М) са случаите на аденокарцином на стомаха при плъхове.
В експерименти с плъхове пет седмици на възраст чрез 66-76 седмици след началото на подаване на токсичен фъстъчено брашно в двата случая, се наблюдава появата на типична stomach- аденокарцином в един случай маркиран обрасли метастази, хистологично идентичен аденокарцином. В последващи експерименти, шест мъжки плъхове на възраст от една година, получени токсични фъстъчено брашно с 3-4 мкг токсин (50% от храната). Три от петте експериментални животни оцелели повече от 39 седмици, намерено анапластичен хепатоцелуларен kartsinoma- един от тези животни, образувана впоследствие аденокарцином на ректума, от друга - стомашен аденокарцином. При експерименти с малки плъхове, хранени в продължение на три седмици диета с токсичен храна, след което нормално, един от шест животни чрез 106 седмици съдържание на нормална диета е диагностициран рак, стомашен Капоши.
Така афлатоксини са от интерес за изследването и очевидно са етиологичен значение в случай на чернодробни карциноми при хора в географски райони, където продължителна употреба може slabotoksicheskih фъстъци продукти.
Изследването на токсичността и канцерогенността на афлатоксини в патета за да се установи доза, която, без причиняване на смърт на животните в експеримента ще позволи да се възпроизвежда характерните патологични признаци (Wogan, 1965). Хистопатологично анализ показва, че степента на епителна хиперплазия, жлъчните пътища, чернодробна унищожаване паренхимни клетки и повишаване на теглото на животните зависи от дозата на токсина.
Тествани дози 2-31,25 мкг афлатоксин В1 на пате прилагат орално в продължение на пет дни и седмия ден птици бяха пожертвани и беше проведено аутопсия. Съгласно опитите, дневна доза от 1.56 цд на животно причинява депресия на растежа и чернодробна атрофия патета, но всички дози се прилагат в различна степен предизвика пролиферация на епителни клетки на жлъчните пътища, което е по-голямо, по-голяма от общата чернодробна щетите (т. Е. висше доза). Най-различни промени в метаболизма на глюкозата - намаляване на съдържанието на гликоген, увеличени липид - маркиран с афлатоксин В1 доза 6 мг на 100 г живо тегло.
Афлатоксин В1 нарушава метаболитната функция на черния дроб. Патета, когато се прилага в продължение на пет дни при доза от 60 мг / кг значително намалява гликоген съдържание и витамин А съдържание увеличава липид igibirovalos включване на глюкозата в мускулите и левцин (опашка, Wogan, 1964- Allcroft, 1965).
Афлатоксин В1 инхибира много ензими чернодробни клетки и клетъчни структури и намалява активността triptofanpirrolazu tirozintransaminazy при плъхове прилага триптофан, и хидрокортизон (Wogan, Friedmann, 1965- Pong, Wogan. Степента на инхибиране зависи от дозата и продължителността на действие. ИНСТАЛАЦИИ метаболитно нарушение ядрена РНК под влиянието на афлатоксин В1: плъховете се прилагат 5 мг / кг (LD 50) се инхибира чрез включване на цитидин на 62-73%, разнообразна съотношение РНК: ДНК в клетките на черния дроб при 23-28% (Friedmann, Wogan, 1966).
Подобни данни за ефекта на афлатоксин Вх ДНК полимеразна активност, протеинова синтеза (ДНК), се наблюдава образуването на нишковидни форми в E.coli (Wragg Рос, наследодателя, 1967).
Час след приложение на афлатоксин в чернодробните клетки на маймуни и плъхове отбележи образуването капсула около ядрото, инхибиране на митоза в клетки на чернодробните хомогенати повлияни афлатоксин намалява съотношението на РНК и ДНК (Svoboda, 1966- Rogers, Newborne, 1967). При животни, пациенти с цироза на черния дроб, се появява, когато се прилага афлатоксин амплифицира възпроизвеждащи цироза клетки (Lovenstein, LEC, 1966).
Токсичния ефект на афлатоксини на чернодробни клетки обясни неговата способност да се свързват химически DNA, за инхибиране на образуването на трансмитери (пратеници) провеждане на генетична информация за синтез на протеин. Намаляване на синтеза на протеини в инфектираните клетки се случва по време на кратък период от излагане токсин (след 15 мин), въпреки че не клетъчна смърт се наблюдава (Клифърд, Rees, Stevens, 1967). Избистреният други биологични свойства на афлатоксини. В ниски концентрации да унищожи култивирани бъбречни говежди клетки (Juhász, Greczi, 1964), защото вакуолация и унищожаване на маймунски бъбречни клетки, инхибират включването на 14С-левцин в протеини чернодробни препарати (Smith, 1965), инхибиране на митоза диплоидни и heteroploid клетки в културата на белодробната тъкан растеж човешки ембрионални инхибират клетки и ДНК синтеза.
Фъстъчено екстракти инфектирани с A. flavus, проявява висока цитотоксичност при прилагане в монослойна култура telenka- бъбречни тъкани на 48 часа при унищожаването на заразените клетки се наблюдава в цитоплазмата и ядрото на афлатоксин концентрация от 0.1 - 0.5 гр / мл. В тези експерименти Gyuhaz и Grekzi афлатоксини от токсични фъстъци се екстрахират с метанол и се пречиства с хлороформ и вода, след това с метанол и петролев етер, а също и чрез хартиена хроматография, като се използва разтворител на смес от н-бутанол, оцетна киселина и вода (4: 1: 5 ). В експериментите на авторите не са имали токсичност съдържащ афлатоксини петролни фракции прасеца бъбречни клетки (т.е.. Е. Lipid), беше 0.1 токсичност метанол фракция (aflatoksinsoderzhaschey). Елуатите петна с Rf-голяма от тази на афлатоксини също са токсични. Авторите смятат, че в допълнение към токсични афлатоксини във фъстъци с има и други цитотоксични метаболити.
Задайте чувствителността на пилешки ембриони на афлатоксини. Тествани чисти препарати от афлатоксини В1, G1, екстракти от култура toksinobrazuyuschey A. flavus, афлатоксин В1 получено от суров препарат от тънкослойна хроматография. Като контрола, екстракти бяха инжектирани съответстващ незасегнати гъбички фъстъчено и изделия от тях. Разтворът се впръсква в кокоши яйца White Ливорно порода преди инкубацията. Въведение афлатоксин се извършва по два начина - чрез жълтъчната торбичка, или камерата за въздух. Токсин се прилага в разтвор на пропиленгликол в количество от не повече от 0.04-0.05 мл и четири дни на инкубиране, са избрани всички нежизнеспособни ембриони. Установено, че афлатоксин токсичност за пилешки ембриони зависи от начина на приложение на токсина: LD50 съответства на 0,25 микрограма, когато се прилага чрез камерата въздух и 0.048 г - когато се прилага чрез жълтъчната торбичка (Фигура 20).
При високи дози на афлатоксин В1 повечето ембриони загиват по 8-10 дни, при по-ниски - до 21 дни. Афлатоксин G1 значително по-малко токсични: въвеждането му в жълтъчната торбичка в доза от само 1 MKG причинява смъртта на 60% от ембрионите, при доза от 2 мг - 90%. В ембриона, убит от въвеждането на афлатоксин В1, в повечето случаи, има рязко намаляване на скоростта на растежа, оток, кръвоизлив, хипоплазия на мезенцефалона (ембриони убити седем дни) - повърхността на черния дроб е надупчена с и пелетизиран. Останалите компоненти на афлатоксини (В2 и G2) са нетоксични към пилешки ембрион (Verrett, Marliac, Лафлин, 1964).

Фиг. 21. Ефект на афлатоксин В1 на броя на клетките в културата човешки ембрионални белодробни тъкани (концентрация от 0.5 до 5.0 г / мл).

Фиг. 20. Токсичността на афлатоксин В, за пилешки ембриони (смъртност 21 минути ден-1 - инфекция чрез жълтъчната торбичка, 2 - чрез въздушна камера).
Наследодателя, Uaysrou (наследодателя, Withrow, 1964) изследват ефекта на две препарати афлатоксин комплекс, съдържащ 15% В19 9% Gl9 по-малко от 1% от В2 и G2 (първата) и 25% от В1, 17% G1 и 2-5% В2 и G2 (втори) и кристална афлатоксин В1 на митоза на култивирани човешки ембрионални белодробни клетки. Афлатоксин в разтворител се прибавя към средата. Инхибиране на митозни heteroploid клетки от 50-55% се наблюдава при концентрация от 0.5 мкг / мл на афлатоксин, диплоидни клетки с 50% в сравнение с контролите - в концентрация от 0.1 мкг / мл (Фигура 21). Авторите смятат, че степента на потискане на митоза в продължение на 24 часа може да бъде определена 0.01 гр / мл афлатоксин в материала.
Афлатоксин в зависимост от концентрацията показват инхибиторен ефект върху растежа на културата heteroploid човешки ембрионални белодробни клетки, протеини синтез процеси, причинени промяната в тяхната морфология. При ниски концентрации (0.05- 0.1 мкг / мл) и след 48 до 93 часа след добавяне на броя на клетките се повишава в сравнение с контрола, но при вземане на 5 мкг / мл имаше рязко потискане на растежа, намаляване на афлатоксин belka- в концентрации 0, 5 мкг / мл на изброените симптомите се проявяват особено силно от 65-93 часа след инжектиране (Фиг. 22-24). Рентгенографски метод с белязан тимидин изследван ефектът на ДНК синтеза афлатоксин. Клетките се инкубират с токсина в продължение на 16 часа, след това се инкубират за 20 минути в разтвор на белязан тимидин, в концентрация от 0.5 мкг / мл, след което средата се отстранява и се заменя с прясна смес от равни с различни инкубиране и след 12 часа, клетките се разделят и след подходяща обработка определя броят на белязани клетки е не по-малко от 1000 разгледана във всеки експеримент изпълнение. ДНК синтеза се инхибира с 40% при концентрация афлатоксин 1 мкг / мл, суровият препарата е по-ефективен от кристален. Инхибиторният ефект зависи от времето на инкубиране с токсин клетки (вж. Фиг. 23). Морфологичните промени на ембрионалното белодробна клетъчна култура човешки изразени в образуването на гигантски клетки, чийто брой е в концентрация от 0.1 мкг токсин / мл след 12-18 часа почти двойно в сравнение с контролите (0.3%). Монтирани биологични свойства на афлатоксин - инхибиране на митоза, инхибиране на ДНК биосинтеза, излишък образуването на гигантски клетки, канцерогенност - довели автора да се смята, че афлатоксините са подобни на добре проучени алкилиращи агенти, които не са мутагенни и antineoblasticheskimi агенти.
Таблица 13
Токсичност афлатоксин (48 часа) в клетъчни култури

Забележка: TD50 - токсична доза (концентрация на токсин), причинява загуба на 25-50% kletok- ID50 - инхибиране доза причинява намаляване на клетъчен протеин от 50% - LD60 - летална доза причинява смърт на 50% от ембрионите на пилета и патици.
Афлатоксин в много ниски концентрации индуцира някои лизогенен бактериофаг култури (наследодателя, 1966) (фиг. 25).
ИНСТАЛАЦИИ афлатоксин В2 токсичен ефект върху клетките на различни тъканна култура. Тя се определя чрез морфологични промени, броят на клетки в култура, съдържанието на протеини и нуклеинови киселини. Най-чувствителни към токсина се оказа патешки ембрионални клетки, а след това от човешки черен дроб, пилешки ембрионални клетки не-La (табл. 13).

Фиг. 22. Ефект на афлатоксин В1 в митоза, в зависимост от концентрацията на (а) и време за действие (б) (1 - средно три определяния, 2 - индивидуална дефиниция).

Фиг. 23. Ефектът на афлатоксин В1 в биосинтеза на протеин в културата на човешки ембрион на белия дроб:
1 - контрол, 2 - опит (0.5 мкг / мл токсин).

Фиг. 24. Инхибиране включване H3-тимидин в ДНК, като функция от концентрация на афлатоксин (и) и време за действие (б):
1 - контрол, 2 - суров афлатоксин 1 мкг / мл, 3-5 - афлатоксин В1 1.0- 0.1 при концентрация от 0.05 мкг / мл.

Първоначалният ефект на токсина е показано на инхибирането на клетъчния растеж, повишаване на гранулиране, закръгляване накрая висящи от стъкло клетката. Минималната доза, при която тези характеристики не се срещат по-малко от 25% от клетките, е: за черния дроб и патешки ембриони - 0.1 пилешки ембрионални-1-5 клетки не-La-5 мкг / мл. Чувствителност патица ембрионални клетки е 4-5 пъти по-високи от пилешки ембрионални клетки. Намаляването на броя на клетките (т.е.. E. Инхибиране на тяхното разделяне) и увеличава съдържание на протеини, ДНК, РНК основава на живи клетки потвърдени според авторите, възможността за разширение (фиг. 26) (Gabliks, Schaeffer, Friedman, Wogan, 1965) ,

Фиг. 25. Ефектът на афлатоксин В1 на индукцията на фаг в стафилококус ауреус (M204). На вертикалната ос - индукцията на индекса - броят на фагови петна в експеримента, в сравнение с негативната контрола.
За афлатоксин чувствителни, много видове животни (патици, пуйки, носачки, пилета, свине, телета, крави, кучета, порове, маймуни).

Фиг. 26. Влияние върху растежа на афлатоксин В1 (броят клетки) Flavobacterium aurantiacum, количеството на протеин, РНК и ДНК, основаващи се на културата на (а) и на живата клетка (б):
1 - контрола (инкубиране в продължение на 30 часа), 2-4 - концентрации афлатоксин съответно 1.0- 0.1 5.0 мкг / мл.
При хранене маймуни резус афлатоксин до 1 мг на ден при животните две седмици разработени летаргия, анорексия, и 4 седмици по-късно те умряха. При говеда, храненето на заразен фураж A. flavus, причинени депресия, остри производство намаляване мляко, загуба на апетит, ponos- при аутопсия маркиран подкожно кръвоизлив, асцит, хиперплазия, жлъчните пътища клетки, мастна дегенерация, некроза и фиброза на черния дроб, бъбреците оток и бъбречна епител дегенерация белтъчен каналчета. Овце, кози и зайци са токсични щамове, изолирани от торта и силаж. Относително характеристика стабилност за плъхове, бели мишки, овце.
Токсичен хепатит епизоотии в прасета в САЩ южните състояния, свързани с наличието на щамове фураж aflatoksinoobrazuyuschih на A. flavus. В експериментален афлатоксикоза или добавяне на кристален токсин в храна възникне заболяване подобен на този, наблюдаван ин виво (Wilson и сътр., 1967).
Степента на патологичен ефект зависи от дозата на токсина. В експерименти Gintts и служители в прасета 12-14 седмици, лекувани с ниски дози афлатоксин В1 г. доведе до лека промяна в теглото и намалява смилаемост korma- в доза, която причинява смъртта на животните, имаше силно изразена чернодробна дегенерация (Hintz, Booth, 1967). В експериментален афлатоксикоза показано, че смъртта на плъхове и скоростта на образуване на тумори на черния дроб или друг орган, зависи от съдържанието на протеин в диетата (Мадхаван, Gopalan, 1968).
Във връзка със създаването на токсичността на афлатоксин е не само за патици, но и за други животни, на редица интересни изследвания на съдбата афлатоксин в тялото, най-вече във връзка с обяснението на въпроса: дали токсично мляко от крави, хранени диети, съдържащи афлатоксин съдържащи фъстъчено?
Показано е, че екстракти от мляко от крави, хранени aflatoksinsoderzhaschey фъстъчено брашно да причини увреждане на черния дроб в еднодневни патета, подобна на тази, наблюдавана, когато се прилага към тях или токсични афлатоксин фъстъчено брашно. Не е намерено Тънкослойна хроматография върху силикагел афлатоксин В1 в екстракта на токсичен мляко, но намери вещество, наречено "мляко" афлатоксин, "М" -toksinom различни от афлатоксин В1. В тази връзка, афлатоксин В1 проучване трансформация пътеки са проведени в "млечен" токсин в крави и други бозайници.
Изследвахме 2 кг сухи млечни крави, които са хранени с диета с 15% фъстъчено брашно силно токсични. Добив токсичен млечни крави, хранени с фъстъци и трева, заразени с A. flavus, hloroformom- извършени с метанол и след отстраняване на екстракти разтворител на утайката се разтваря отново в 85% метанол, обезмаслени с петролев етер и 40% воден разтвор на метанол се екстрахира с хлороформ. Разделянето се извършва чрез хроматография върху тънък слой от силикагел (0.3 mm). Когато проявлението на плаките с ултравиолетова светлина показа значителни разлики петна екстракти от токсични и нетоксичен мляко. В първия случай ясно наблюдаван лилаво флуоресцентно петно ​​с Rf 0.4, които са разположени над място с жълто-зелена флуоресценция и едва забележим място свързани с v1- афлатоксин във втория случай - петна с ниско Rf, зеленикаво-жълто и жълта флуоресценция. Фъстъчено екстракти инфектирани с A. flavus, дават ясни петна съответстващ афлатоксини В1, G1, мораво място открити по подобен токсичен мляко (фиг. 27). Екстракти от токсични млякото се разделят чрез колонна хроматография върху развитието silikagelya- колони инсталирани фракции са подобни на тези, получени с тънкослойна хроматография.

Фиг. 27. афлатоксини TLC:
А - млечни екстракти (1 - чист афлатоксин В1, 2 - екстракт от краве мляко 3 - извличане на токсични краве мляко, 4 - екстракт култура L. flavus, 5 - млечни екстракт плъхове 6 - токсични екстракт мляко плъхове).
Б - чернодробни екстракти, овце бъбреците и урината (1 - смес от В1 и афлатоксин G1, 2-3 - черен дроб и бъбреци екстракти овцете лекувани с афлатоксини, 4-5 - екстракти от овце урина преди и след получаване афлатоксини 6 -. Екстрахира токсичен краве мляко - контрола). Флуоресцентен: F - лилаво, R - синьо, S - зелено, г - жълт, а-е - синьо-виолетов, NW - синьо-зелен, х-Z - жълто-зелено.
Тест за патета токсичност ден показа, че само една малка част, като пурпурно петно ​​с Rf 0,4, има токсичност и причинява характеристика пролиферацията на епителните клетки на жлъчните пътища на черния дроб, т. Е., че токсичните "млечен" афлатоксини идентична с тази в малки количества в екстракти от заразени с фъстъчено A. flavus (таблица. 14). Експерименти за кърмещи плъхове, инжектирани с афлатоксин В1 или чисти хранени фъстъци, замърсени с A. flavus, показват, че при животни афлатоксин В1 се превръща в "млечен" токсин (Jongh и сътр., 1962). Бътлър и Klayford (Butler, Клифърд, 1965) изследва метаболизма на афлатоксин В1 в относително устойчиви на това животни - плъхове и овце. Плъховете относително стабилни при остри експерименти, еднократно прилагане на афлатоксин В1 маркирани устойчиви чернодробно увреждане характеристика, разработване на по-бавно, отколкото, когато се прилага канцерогенни вещества - тетрахлорметан или диметилнитрозамин.

Токсичност патета хроматографски фракции от екстракти от
токсичен краве мляко

Забележка. Във всяка серия от експеримент четири дни патета (определена от номера), които дневно в продължение на пет дни се получава екстракт, еквивалентни на 3 литра мляко.

Некрозен първо се появява след 36-48 часа и напредва през mesyatsa- чернодробна регенерация паренхим се извършва по-бавно, и този период се характеризира с пролиферация на жлъчните пътища и giperhromatiey паренхимни клетки. Когато единична орална и интраперитонеално приложение на плъхове афлатоксин В1 мъжки при доза LD50 се открие чрез 0.5-1 часа, след 6 часа съдържание афлатоксин В1 е намален, и 24 часа след прилагане на само маркирани релсите. След 2 часа, хроматограмата ясно открива втората точка, като sinefioletovoy флуоресценция с Rf 0,2- го намалява, след като се наблюдава на 6 часа и само следи от това след 24 часа. Подобни компоненти се намират в черния дроб и кръв басейна. Не е намерено Една седмица след последното прилагане на афлатоксин В1 като втори компонент в екстракти от черен дроб на плъх. Така, беше показано, че черния дроб и кръв инактивирането на афлатоксин В1, евентуално частично, и има нов токсични компоненти, подобни на "мляко" токсина. Авторите предполагат, че афлатоксин В1 и неговите продукти на трансформация може да предизвика необратими промени в тъканите на черния дроб на плъх, настъпващите след това, след пълното изчезване на черния дроб (след 24 часа) и хистологично открити само след това време. За еднократно интраперитонеално инжектиране на овца комплекс получаване на 2 часа в чернодробни екстракти бяха открити афлатоксини В1, G1 и "М" -toksin. В екстракти от бъбрек флуоресцентната интензивност на петна В1 и G1 в хроматограмата е по-малък от място "М" -toksina на. Екстрактите от урина след един и два часа след прилагане на афлатоксин право интензивно флуоресценция място, съответстващо на "М" -toksinu, слабо - афлатоксин G1 и В1. Авторите предполагат използването на метод за откриване на "М" -aflatoksina в урината за диагностични цели.
Antyukov (1965-1966), че когато се подава към прасета заразени с храна A. flavus, те имат до 10% намалява количеството на протромбин до 15% - гамаглобулин и 12% - в серумен албумин. Авторът смята, че гъбата възпира belkoobrazovatelnoy чернодробна функция, резистентност на организма и производството на антитела (означени с рязък спад до 77% от фагоцитната активност на левкоцити). Предполага се, че токсични вещества A. flavus първия стъпков двигател и отделителната функция на тялото (1-3 дни след инжектирането), след това натиснете и предизвика рязко чревна атония.

Афлатоксин В1, когато се прилага на мишки инхибира plazmotsitarnuyu отговор на лимфните възли и далака и значително инхибира образуването на антитела (Galikeev, RAIP, Manyasheva, 1968).
Афлатоксин причинява патологични промени в хромозомите бели мишки (Лорна, 1965) показва фитотоксични свойства, причинявайки албинизъм растенията (Schoental, White, 1965).
Таблица 15
Унищожаване на афлатоксин В1 покой клетки Flavobacterium aurantiacum

Забележка. Плътността на бактериалната суспензия 10 'мл.

Действие суров афлатоксин е изследван при 329 различни вида микроорганизми. Получаване афлатоксин екстрахира с хлороформ от заразената ориз A. flavus утаява и хексадекан, съдържащи следните компоненти: В1 - 23.8 В2 - 6,3, G2 - 0,9% (Vagmeister, Hesseltine, 1966). Намира автори тествани 35 видове филаментозни гъби, принадлежащи към 16 родове са устойчиви на афлатоксин в доза от 30 мкг / мл дрожди - концентрация от 40 мкг / ml- са най-чувствителните щамове на В. Brevis (техният растеж се инхибира при концентрация от 10 мкг / мл , докато растежа на някои щамове на В. мегатерий - при 15 мкг / мл).

Фиг. 29. Абсорбцията на афлатоксин В1 автоклавира клетки Flavobacterium aurantiacum.
Ziegler и сътр. (Ciegler и сътр., 1966) са изследвани около 1000 различни култури на микроорганизми, дрожди, филаментозни гъби и техните спори, актиномицети, водорасли и бактерии. Изследвани култура показа значителна устойчивост на афлатоксин В1 и G1 е нараснал и на носители, които го съдържат, но не показва характерните флуоресцентни зони около колонии.

Фиг. 28. Инхибиране на растежа Flavobacterium aurantiacum афлатоксин В1:
1 - контрол, 2 -3 - концентрация от 10 и 15 мкг / мл.
Афлатоксин разрушава повечето щамове на Pseudomonas видове или унищожи изследваните щамове на дрожди, актиномицети, водорасли. От микроскопични гъбички афлатоксин понякога представители серия инактивиран А.нигер (след относително дълъг период на инкубиране - 11 дни). В последния случай афлатоксини В1 и G1 не са открити, и се открива нова, с по-интензивно синьо флуоресцентно вещество с Rf 0,25. В Penicillium raciborskii след растеж на среда с афлатоксин В1 в хроматограмата на разработване средство с Rf, Rf близо до афлатоксин В2. Спорите на повечето видове гъбички не са специално адсорбирани афлатоксин, той бързо се отстранява след лечение с хлороформ, но частично преобразуваната конидии на A. terreus, A. flavus и A. luchinesis в серия от съединения, имащи светлосин флуоресценция. Афлатоксин се разрушава щам само Flavobacterium aurantiacum, отглеждане и в покой клетки от които голяма част от използвания токсинът се вземат за 88-112 часа инкубация (Таблица. 15). Високите концентрации на токсин инхибира растеж и предизвиква образуване на атипични клетки (Фиг. 28). Абсорбцията на афлатоксин се намалява с повишаване на концентрацията му в инкубационната среда. F. aurantiacum автоклавира клетки също притежават способността да абсорбира афлатоксин В1 от разтвора (фиг. 29).
Таблица 16
Абсорбцията на афлатоксин водни живи клетки и автоклавира Flavobacterium aurantiacum

Живите клетки Е. aurantiacum абсорбира афлатоксин добавя към разтвори на мляко, фъстъчено масло и фъстъчено, царевично, соево, изкуствено заразено toksinobrazuyuschim щам A. flavus. Разтвори, съдържащи токсина към клетки след инкубиране Е. aurantiacum, не са токсични за патета.
Клетките Е. aurantiacum, отглеждани при концентрация афлатоксин до 50 мкг / мл или по-висока, се получава променени форми - увеличение на удебелени краища, често разклоняване. Не са наблюдавани Подобни промени в клетъчната морфология, когато се отглежда в среда с пеницилин. В се наблюдава при 73 и 96% след 28 часа 10 и 15 мкг / мл на афлатоксин В1 инхибиране ДНК биосинтеза, токсинът се абсорбира напълно от растящи клетки Е. aurantiacum. Когато четири минути ултразвук на клетки след излагане на афлатоксин концентрации от 2.5 и 5 мкг / мл, съответно маркирани 25 и 35% счупени клетки в сравнение с 15% при контролите. Следователно, токсин клетки са по-чувствителни към лечение. Грозни форми са открити в концентрация от 2.5 мкг / мл, малко намерено - при 5 мкг / мл. Афлатоксин В1 абсорбира клетъчните стени на бактерии, както и автоклавирани клетки. Въз основа на това, авторите смятат, че токсинът засяга образуването на клетъчна стена.
Живей и автоклавирани клетки поглъщат определено количество афлатоксин В1, независимо от продължителността на инкубационния период, но доста по-различно усвояване характер. В първия случай, абсорбцията афлатоксин контакт клетки и не преминава в разтвора при подходяща обработка във втория - лесно преминава в разтвор от промиване с вода клетки (Таблица 16)..
Според Arai и сътр. (Arai, Tatsuya, Koyama, 1967), много Грам-положителни и Грам-отрицателни бактерии са резистентни на афлатоксин концентрации от 100 мкг / мл, но растежа на Streptomyces и Nocardia щамове тествани се инхибира от авторите на