Култура медии - микробиология с техниката на микробиологични изследвания

За решаване на основните проблеми бактериологично изследване (изолиране на чисти култури от бактерии, определянето на техните биологични свойства, и така нататък. Г.) трябва да бъде в състояние да растат микроорганизми в лабораторията. Това се прави в хранителните среди. Правилно варени питателна среда зависи успехът на лаборатория микробиолог.
Съставът на хранителната среда трябва да включва:

1. Вещества, необходими за растежа и възпроизвеждане, както и за изграждане на бактериалната клетка: източници на азот, въглерод, кислород и водород.
2. Съединението от неорганична под формата на различни соли.
3. Бактериалните витамини, или така наречените фактори на растежа.

В допълнение, хранителната среда трябва да има определен вискозитет, влажност, и реакционната среда. Микробите се адаптират към някои варианти на тази реакция, но за всеки микроб граници след което тези колебания не трябва да преминават.
В микробиологична практика, има много голямо разнообразие от хранителни среди. В зависимост от техните свойства, състава и предназначението на хранителна среда, могат да бъдат разделени в няколко групи.
По произход разграничени: а) медии природен култура и б) изкуствени среди за култивиране.
Първата група включва серум, жлъчка, яйца, мляко, картофи, моркови. втората групата - медиите растеж получава от месо или растителни тинктури, към които се добавят различни азотни продукти, въглехидрати и соли, като месо-пептон, месо-пептон агар и др ...
Консистенцията на средата се отделя в твърда, полутвърда и течна. Към гъста среда отнася месо-пептон агар хранителен желатин, суроватка сгънати, сплескани яйчен протеин, картофи и др .. полутечен културалната среда е 0.5% месо-пептон агар. Това се отнася до течна среда месо-пептон бульон, пептонова вода, захар бульон и др.
В състава на всички носители на културата могат да бъдат разделени в три групи:

1. алкална среда, или прост, използвана за отглеждане на повечето патогенни микроби (месо-пептон, месо-пептон агар, месо-пептон желатин и др.);
2. специална среда, или избираем, използвани за изолиране и отглеждане на някои патогенни бактерии, които в обикновени носители слабо или не растат (захар бульон, холева бульон агар с кръв и др.);
3. Диференциална диагностични среда, служи като една от помощни средства в определянето (идентификация) на чиста култура на тест микроорганизъм (въглехидрати разноцветни брой Хис, агар Endo и др.).

Видео: среди за медицинска микробиология. Част 2.

Получаване на културална среда

Основната среда за култивиране

Най-често срещаният течната среда е месо-пептон бульон. Той се готви да заколи водата.
Месо вода. Ситно нарязан месо, освободен от мазнини и рамо, се смесват в тегловно с двойно количество вода (500 грам вода + 1 L), настоява 24 часа при стайна температура, филтрува се през парче плат и добре дренирана месо остава върху него. Месо вода е червеникаво течност кисела реакция. Той съдържа разтворим протеин вещество (албумин), Екстракти и някои сол. Месото се преварена вода до протеин сгъване и се филтрува през филтърна хартия. За да се пести вода, месо се излива във флакони или бутилки и се стерилизира в автоклав при 120 ° в продължение на 20 минути (вж. Стр 74). В момента метод използва широко като горещо пълнене екстракция без това чрез накисване в студена вода. Каймата с топла вода 1/2 часа, без кипене и след това се вари 1 час. Този метод е най-добре се радваше през лятото.
Получаване на бульон месо-пептон. Месо бульон се получава от вода, към която хранителни вещества за подобряване на свойствата добавя пептон (1%) и натриев хлорид (0.5%), т. Е. В 1 литър вода вземат месо пептон 10 гр и 5 г натриев хлорид. Сместа се нагрява под обратен хладник в продължение на 10-15 минути при постоянно разбъркване. Така пептон и сол се разтваря. Полученият бульон е кисела, при която най-патогенни микроби предотвратява растеж. Ето защо е необходимо да се направи реакцията леко алкална.
За да се установи реакция трябва да има индикатор разтвор и се титруват разтвори на основи и киселини. В бактериология използват различни показатели, т.е. вещество, чийто цвят варира в зависимост от реакционната среда, като лакмус, фенолфталеин, т-нитрофенол, р-нитрофенол и др Litmus най-често се използва под формата на лакмусова хартия, фенолфталеин -... А 0 , 5% разтвор на алкохол metanitrofenol- 0.3% воден разтвор на (дестилирана вода) и пара-нитрофенол - като 0.1% воден разтвор, киселини и основи - като нормален решения. След създаването на реакция бульон се вари, филтрува се и се стерилизира.
Създаването на хранителната среда на реакцията. Понастоящем често използван метод за определяне на реакционната среда е колориметричен метод Michaelis. Същността на метода се основава на промяната в цвета на индикатора в зависимост от степента на дисоциация. Това е причинено от водороден йон концентрацията на течност проба.
Неутрално рН съответства на рН 7,0-<7,0 обозначает кислую реакцию, рН>7,0 — щелочную реакцию. Для колориметрического метода нужно иметь наготове большее количество различных кислых и щелочных растворов, активная реакция которых (pH) заранее определена электрометрическим путем. Эти стандартные растворы должны быть подобраны так, чтобы получилась целая шкала с постепенно нарастающей щелочностью (pH): 5,0- 5,2- 5,4- 5,6 и т. д. Обычно Для определения pH пользуются стандартными растворами в запаянных пробирках, которые установлены рядами в специальном ящике с крышкой.

Фиг. 22. Михаелис сравнителен продукт (обяснение в текста).

За определяне на рН, се използват за сравнение, който е дървен блок върху горната повърхност на който има б отвори (3) в две редици от същия размер като се използват тръби. Епруветки за половината си дължина са включени в единицата като обикновен статив. Сравнителен гладки странични повърхности и предната и задната стена са проходни отвори, през които преминава светлина. (Фиг. 22) на задната стена на отворите се добавя мат (мляко) и синьо стъкло.
Определяне на реакционната среда култура е както следва. Отворът 2 на сравнителен поставена тръба с 2 мл хранителна среда, към която се прибавя 4 мл дестилирана вода и индикатор 1 мл (мета- или пара-нитрофенол) в отвор 5 - тръбата, съдържащ дестилирана вода. В otverstvija 1 и 3 вмъква във флакони, съдържащи 2 мл от същата хранителна среда с 5 мл дестилирана вода (без индикатор). Отворите 4 и 6 за получаване на стандартни тръби с такива параметри рН, между които иска да създаде реакционната среда. В 2-ра или 1-ви или 2-ри и 3-ти тръбите при преминаваща светлина през отворите в страничните стени на сравнителен да получите точно същите нюанси на цвят течности. реакционната среда съответства на стандартна реакция, с която съвпада цвят. Ако цветът ще бъде по-лек от втория епруветката от стандарта, след това се прибавя на капки реше-
Нормално основния разтвор, докато оцветяване не става равна на стандарта. След като изчисленото количество алкален е необходимо да се установи реакция 1 L от средата, на базата на количеството на алкален, добавени към 2 мл бульон.
Пример. Трябва да се настрои на 7,4 тестовата среда рН. Отворите 4 и 6 се добавя в стандартен тръба с наименование рН 7,4 и 7,6. Епруветката се поставя в отвора 2, се излива на капки от мерителна пипета децинормален разтвор на натриев хидроксид, докато докато цвят, съответстващ на стандарта с желаното рН. Ако за установяване на рН в 2 мл среда се 0,2 мл от десет нормален разтвор на натриев хидроксид, след това 1 L изисква 0,2 X500 = 100 децинормален мл или 10 мл нормален разтвор на натриев хидроксид. След стерилизацията на среда рН често се модифицира за намаляване на алкалността преди стерилизация трябва да се създаде малко над желаното рН (0.2). Твърди хранителна среда разтопено преди определяне на рН. Определянето се извършва, както е описано по-горе.
Наскоро освободен за продажба Михаелис устройство за определяне на рН на средата микрометода.
Получаване на агара за месо-пептон. За месо-пептон се добавя бульон от 2 до 4% (в зависимост от сорта) нарязан агар-агар и се нагрява до пълно разтваряне. След това се оставя да се охлади до 50 ° и се прибавя към яйчен белтък осветлението на (1 л агар вземат разклаща и се разбърква вода с малко количество от яйчен протеин), разклаща се добре и се поставят за 4-5 минути в автоклав. Протеин коагулира при кипене и се увлича суспендираните частици. Получената мътна течност се филтрира на горещо през памук, напоена с топла вода. Можете да го направите без яйчен белтък, но агар получава достатъчно просветени. Филтрува на горещо агар дозира в епруветки в 5 до 8 мл в колби или 50-500 мл и се обработва в автоклав в продължение на 20 минути при 120-125 °. След стерилизацията, епруветката с течен агар трябва да бъдат поставени почти хоризонтално агарови наклонени замразени в позиция с голяма повърхност, или го да се втвърди под формата на колона. В първия случай тя ще скосени. агар, във втория - колона (Фигура 23).. Наклонена трябва да бъде на дъното на водата тръби кондензация необходима за нормалното функциониране на микроби.

Фиг. 23. Тръби с агар агар наклонени и колона.

М I о-пептон желатин. За 1 литър месо вода се прибавя 1 г пептон, 5 г натриев хлорид и 100 или 150 грама на ситно нарязан желатин. Оставя се да престои в продължение на няколко часа, за да желатин подути. Получената смес се затопля до пълно разтваряне на желатина. Е избран леко алкална реакция, осветяване на яйчен белтък, филтрува се през памук, напоена с вряща вода. След отливане, средата се стерилизира в апарата Кох 3 дни в продължение на 60 минути всеки ден. желатин не може да се стерилизира в автоклав, защото тя след това губи способността си да се втвърди. Желатин се топи при 23-25 ​​° С и отново се втвърдява при температура под 22 °.

Хранителни носители за смилат Hottinger. Основното решение Hottinger успешно замести месото вода. Това се получава, както следва. Нарязва на малки парченца 1 кг месо, се поставя в съд, съдържащ 1,5 л кипяща вода и се кипи в продължение на 15-20 минути. След това месото е хванат и смазан в месомелачка. Охладената течност до 40-45 ° С и се излива в бутилка се прибавя 1,5 г сода, 3-5 грама на панкреатин и 15-20 г хлороформ, веднага затваря с гумена запушалка и се разклаща. За тази течност се добавя раздробено месо, жлъчката (20 мл жлъчни на 1 кг кайма), разклаща се и се оставя бутилка да престои при стайна температура в продължение на 5 дни или по-дълго (течността в бутилката всеки ден, няколко пъти на ден разбърква), докато съдържанието на неговите превръща в прозрачни, дълбоко жълта течност с фина утайка на дъното. Реакционната достатъчност смилане се определя на триптофан. Тогава филтрираната течност се излива във флакони, и се стерилизира в автоклав при 120 ° в продължение на 20 минути. За получаване на бульон този основен разтвор се разрежда с дестилирана вода 3-5 пъти или 10. Количеството на разреждане зависи от целта, за която тази среда е предназначен микроорганизми, както и качеството на получения разтвор Hottinger. За да се извари вече разведена Hottinger добавя 0.7% натриев хлорид и 0.1 т / о калиев фосфат (К2НРО4), варен, задаване на желаната реакция отново на обратен хладник, филтрува се през хартиен филтър, отново се провери реакцията се излива в епруветки и флакони и се стерилизира в автоклав при 120 ° в продължение на 20 минути.
Разтваряне в хранителна среда агар или желатин за получаване на подходящ твърд носител.
Пепто Мартин и бульон от него. Вземете свински гърди, без наличие на мазнини и без измиване, преминали през месомелачка. Кайма спуска в бутилка от 250 грама и се излива разтвор на солна киселина (1 L загрява до 50 ° чешмяна вода + 10 мл димяща солна киселина). Сместа се оставя да се извари в термостат при 45-50 ° до мляно още не са превърнати в прахообразна маса и няма да се появи положителна реакция на триптофан. Смилането обикновено продължава 48 часа. Така полученият огнище пептон се стерилизира в бутилки при същото налягане от 1 атм (над нормалното).
За получаването на бульон Martin бутилка пълнене течност сифон или пипета Mora голям капацитет, филтрува се през памук и се добавя равен обем вода месо. След инсталиране на необходимата реакция бульон се кипи в продължение на 30 минути, оставя се да се утаи и се филтрува през кърпа или филтърна хартия, се дозира в епруветки и колби и накрая се стерилизира при налягане 0,5 атм за 30-40 минути.

Специално медийна култура

Захар и захар бульон агар се получава чрез добавяне на бульон или конвенционален разтопен агар просто добавяне на въглехидрати в количество от 0.5 до 1%. Карбохидратът се разтваря в малко количество вода и след това се добавя към хранителната среда. Стерилизация захар бульон и агар се извършва в единицата на Кох 3 поредни пъти в продължение на 1 час.
Агар с кръв, серум или асцитна течност се получава под строг асептика. Към готов слабо алкална разтопено и отново се охлажда до 45 ° агар дозира в епруветки или флакони, се добавят 20-25% стерилен серум или асцитна течност или 5-25% стерилна дефибринирана кръв. След пълно смесване (за да се избегне образуването на мехурчета и пяна) агар в епруветките се коси и съдържанието се излива във флакони Geidenreich чаши.
Бульон със серум, асцитна течност, или кръв, приготвена по същия начин като агар, но без нагряване. За да се следи стерилност бульон поставя в термостат за 48 часа при 37 °.
Сряда Leffler. Серумът получен от кръвта на кон, бик или овен. Три части от получения серум се смесва с една част от слабо алкална захар бульон (1% пептон, 0.5% натриев хлорид и 1% глюкоза) и предоставени за тестване на тръби в 8 мл. Епруветките се поставят в специални апарати за съсирването в наклонено положение и се нагрява в продължение на 1 час при 80-90 ° в продължение на 3 дни. В този случай, серум съсирва. За да се следи епруветки стерилност поставят за 48 часа в термостат при 37 °. По същия начин се получават от навити тръби конски серум, неразреден бульон (Medium Ru). Отоплението трябва да се направи бавно, за да се избегне образуването на мехурчета. Сряда използва, за да се подчертае дифтерия бацили.
Диференциална диагностика среда.
Сряда Ендо. Получава непосредствено преди употреба. К SO мл месо-пептон агар или бульон Hottinger агар (рН 7,6) се прибавя 1 г стерилна химически чиста лактоза, разтворен в 5 мл стерилна вода, охлажда се до 70 ° С и сместа се прибавя 0,5 мл наситен разтвор на основния фуксин и 1 25 мл прясно приготвен 10% разтвор на натриев сулфит, разбърква се и се изсипва в чаши. За сушене на отворена чаша се поставя в продължение на 30 минути в термостат при 37 °.
В сряда Ендо Е. Coli колонии дава червено с метален оттенък, и бактериите коремен-паратиф и дизентерия група - безцветни колонии (виж фигура 77 в Притурката ..).
Motley брой на въглехидрати (Хис сряда). К SO мл вода се прибавя 1 г пептон, 0.5 г от готварска сол. Пептон и сол се разтваря в гореща вода за няколко минути и се филтрува през филтърна хартия (разтворът трябва да бъде напълно прозрачен). Коригирана рН 7,0. В тази среда се разтварят 1% въглехидрат прилага към дъното на епруветките се понижава поплавъци за улавяне на газове (удостоверяващ разцепване на дълбоките захари) и се добавя индикатор. При използване като показател:
а) лакмус тинктура - 5 мл на 100 мл носител. В кисела среда лакмус тинктура показва зачервяване, алкална - posinenie- б) azolitmin, който е пречистен препарат на лакмус, неговата калиева сол (в 1 литър среда се прибавят 0,25 гр azolitmina) - в) bromtimolblau - за 1 литър среда 1 мл 1.6% алкохолен разтвор на индикатор (средата става зелено, синьо в образуването на алкален пожълтяване при образуването на киселина) - ж) Andred индикатор, който се състои от 1 грам на киселина фуксин, 400 мл дестилирана вода и 64 мл нормален разтвор на натриев хидроксид. Към средата се добавя 1% индикатор. Средата в тръбата трябва да закупите сламеножълт цвят, без розов цвят. В кисела среда на цвета на средата се промени до червено (фиг. 24 вложка).
Индикатор добавя към културалната среда, за да се определят промените на реакцията срещащи се под влиянието на ферментация на въглехидрати, т. Е. За откриване на микробен биохимична активност. Последното е важно за микробиологична диагностика на редица инфекциозни заболявания (коремен тиф, дизентерия, холера, и т.н.). Среда с индикаторни въглехидрати и се разпределят в стерилни ампули и се стерилизира чрез фракционна при 100 ° в продължение на 3 дни.

Видео: реколта вода на микроби

Суха медийна култура

Използването на сух хранителни среди става все по-практично. Стандартизация, лекота на съхранение, транспортиране и производство направи суха хранителна среда, е много удобно да се работи.
Суха медийна култура са бледожълто хигроскопичен прах, без бучки с влага до 10%. В сухо място, в добре запечатани ястие може да се съхранява за дълъг период от време. Те трябва да бъдат добре разтваря в дестилирана вода при стайна температура в концентрация от 1.5-6%.
Суха хранителен бульон. 25 грама на прах се разтваря в 1 литър студена дестилирана вода, докато се затопли до, дозира и се стерилизира. След стерилизация при 120 ° в продължение на 15 до 20 минути до получаване на бистър, без утайка разтвор на бледожълт цвят, с неутрално рН. От сух бульон на хранителни вещества може да бъде приготвена хранителна среда диференциални въглехидрати, хранителен агар и твърди диференциална среда.
Суха хранителен агар. За да се прибавя 1 литър дестилирана вода, 50 грама от праха се стопява, регулира желаната реакция се прекарва през памучна марля-филтър, минерална и се стерилизира при 120 ° в продължение на 25-30 минути.
Суха Ендо агар. 5 г бледо цветове лавандула прах (тленен повлиян лъч) се излива в 100 мл студена дестилирана вода и след това се стапя и се вари в продължение на 5 минути. След охлаждане до 50 ° разбърква маса (за равномерно разпределение на утайка) и се разпределят в чаша.
Хис среда с въглехидрати и показатели BP.

1 г прах се изсипва в 100 мл студена дестилирана вода, нагрява се до разтваряне, разпределят в стерилни епруветки с поплаваците и стерилизират в продължение на 5 минути при 110 ° (съгласно инструкцията). Се освобождава и втора модификация на средата - полу-течност (без разливане поплавъци). Средно след стерилизация и охлаждане имат жълто-розови или бледо розово. Течната среда е прозрачен, полутечни с опалесцентен. индикатор BP е смес от киселина и вода rozolovoy синьо мастило. В киселата среда на показателя има наситен син цвят в алкална - от леко розово до червено.

Суха жлъчката. 7 грама на прах се разтваря в 100 мл вода се излива, се стерилизира чрез автоклавиране. Използва се като обогатяване изолация медии с бактерии от кръвта на коремен тиф и паратиф.
Суха среда Leffler. 100 г от праха се стрива в хаван с малко количество топла вода до получаване на хомогенна маса, се прибавя топла вода до 1 литър, филтрува се през два слоя марля, разпределени в епруветки и се стерилизират в Convolutors Koch продължение на 3 дни при 90 ° С в продължение на 1 час.
Whey индикатор BP. 1 г прах сиво цвят лавандула се излива в 100 мл студена дестилирана вода се излива в епруветки и се стерилизира чрез преминаващ пара в продължение на 20 минути. Сряда аметист цвят. Пръчици коремен тиф и дизентерия не променят цвета на околната среда. С развитието на Е. коли сряда рязко става синьо. В оцветени бактерии паратиф среда синьо.

Филтруване и наливане на хранителни среди

Течни хранителни среди и стопения желатин се филтрува през нагънат филтър или филтърна хартия, предварително навлажнен с вода, или чрез филтриране плат, наложено върху стъклена фуния. Практически употреба бельо филтри, тъй като те могат да служат за дълго време, докато хартиени филтри се използва само веднъж. Филтриране агарни среди памучно марля филтър. Агар се излива върху горещ филтър. След филтруване, културалната среда се излива в съдове (бутилки, епруветки).
Леене тръба на хранителни среди са фуния или buret към долния край на която е монтирана на кратко гумена тръба с малка глава и стъкло-скоба Mora.

Видео: Отглеждането на микроби - Елизабет Bonch- Osmolovskaya