Допълни тест за свръзване - микробиология с техниката на микробиологични изследвания

свързване на комплемента (РСК)
Съединение антитяло към антиген и комплемент не са непременно придружено от разрушаване на антигена. Това. най-вече се отнася за микроби, които са устойчиви на спадаща действието на комплемента. Какво се случва в тези случаи, свързващ комплемента може да се открие косвено чрез използване на метода на открита и S. J. Bordet Генгоу. Същността на метода е, както следва. В реакцията на имунната серума със специфичен антиген възниква съединение антиген с антитяло, комплексиран с антиген антитяло, което се свързва с комплемент. В случай на несъответствия антиген и антитяло допълнение свързване не се случи, т.е.. Е. допълнение остава свободна. Свързването на комплемента при реакция положителен антитяло с антигена остава невидима. Следователно, за да се определи дали допълнение контакт или остави свободно, като индикатор в реакцията, се въвежда хемолитична система (хемолитична серум - хемолизин и овчи червени кръвни клетки). Тестът за свързване на комплемента се поставя в два етапа: в първия етап на изследвано серум (антитяло) се добавя към антигена, и допълва, а вторият - се добавя хемолитична система.
Ако първата фаза включва реакцията на серумните антитела, специфични за антигена, комплемента се свързва с антигена + антитяло, добавяне хемолитична хемолиза не се случи и реакционната система се счита за положително.
Ако изпитваното серум не съдържа специфични антитела, т.е.. Е. антиген и антитяло не съвпадат един с друг, а след това комплемента в първата фаза реакция остава свободен и добавяне хемолитична система ще хемолиза (разтваряне) на еритроцитите, т. Е. Реакцията е отрицателен (виж . Фиг. 57).
Реакция Bordet-Генгоу (свързване на комплемента) с висока чувствителност, е натрупала голяма диагностична стойност. Тази стойност се увеличава още повече, когато Генгоу показа, че реакцията може да се осъществи не само с бактериални тела, но също така и с техните екстракти. Реакцията на Bordet-Zhang използва при диагностицирането на сап, гонорея и други заболявания. А. Wasserman, въз основа на идеите на J. Bordet, прилага допълнение реакция фиксиране за serodiagnosis на сифилис. Тази реакция е получила практическо приложение за откриване на сифилис.
допълнителния тест се използва с двойна цел:

1. За откриване на специфични антитела в серум от известен антиген. Например, с антиген, получен от култура на гонорея, гонококов да откриване на антитела в серума на пациента. В този случай е необходимо да се използва доза антиген, който допълни задължителен, предварително vytitrovana значителен брой пациенти серуми.
2. За да се определи формата на антигена с помощта на серум, съдържащ антитела към специфичен антиген. Например, използвайки съответния имунен серум може да бъде идентифициран пръчка коклюш. В тези случаи е необходимо да има силен имунен серум, титърът на който е известен.

Съставки (части) реакция. За реакцията на свързване, са необходими допълнително-коагулант следните съставки: 1) овчи еритроцити, 2) серум хемолитична, 3) на комплемента, 4) антиген и 5) на тест серум.
1. Червените кръвни клетки са получени от кръв defibrin д-та овце. За тази цел овча кръв е взета от югуларната вена директно в съда със стъклени перли. Потресен за 10 минути. Филтруване през стерилна марля, центрофугира и серумът се аспирира. Еритроцитите се промиват три пъти с серум остатък физиологичен разтвор на натриев хлорид центрофугиране в продължение на 10-15 минути. След третото центрофугиране на утайката подготви 3% суспензия от червените кръвни клетки за експеримента. Когато се съхранява в ледник дефибринирана кръвта може да се използва в продължение на 6-8 дни.

Схема получаване разреждания на серум първичен хемолитична разреждане 1: 100

1. Хемолитична серум обикновено се получава от зайци, имунизирани с овчи червени кръвни клетки. Хемолитична серум, произведена в суха форма институции бактериални препарати. Разположен на етикета на ампула серум тигърът и срока на годност.

ТАБЛИЦА 4
Схема титриране на серум хемолитична

Серум хемолитична титър нарече ограничено разреждане в състояние в обем от 0.5 мл от разтвор на 0,5 мл суспензия от 3% от еритроцити в присъствието на 0,5 мл допълнение продължение на един час при 37 °.
Серум хемолитична титър се определя, както следва: приготвя основен vyvorotki разреждане 1: 100 (0.1 мл серум + 0,9 мл физиологичен разтвор), който по-нататъшни разреждания са получени (Таблица 3.).
Броят на тръби последователно измерва в 0,5 мл на получените хемолитични серумни разреждания, вариращи от 1: 1000, се прибавя към всяка епруветка, 0.5 мл допълни разрежда 1: 10 и 0.5 мл 3% еритроцитна суспензия. Титруване на хемолитична серум провежда схема (раздел. 4).
види от диаграмата, че суроватката има разреждане 1: 1500 дава пълна хемолиза (т.е. серумен титър 1: .. 1500). След приема 3 пъти за минимално експеримент разреждане (тройна титър). Например, ако серумният титър на хемолитична 1: 1500 разреждане се използва 1: 500 (Ie .. 0.1 мл серум 49.9 мл физиологичен разтвор).

1. Допълнете. Като допълнение към реакцията служи като серум от морско свинче (допълни тях има най-висока активност) или комплемент-сух, на разположение от институции бактериални препарати.

Тъй като степента на активност на комплемента, не всички морски свинчета е същата, трябва да се вземе кръв от няколко животни и получен серум микс.
Тигърът на комплемента е посочено от първия минималната доза допълва разтваряне еритроцити. Ако, например, в титруване на диаграма пълна хемолиза настъпили в епруветка, съдържаща 0,3 мл комплемента и непълна хемолиза е в епруветката, съдържаща 0,25 мл допълнение, титър допълнение трябва да се разглежда в 0.3 мл 1: 10 разреждане. работен доза обикновено се приема нейно допълнение титър, се увеличава с 20-25%, т. е., това отговаря приблизително на сумата на комплемент, която се съдържа в предпоследния тръба с хемолиза.
Тъй като две контрол (вж. Таблица. 5) се поставят в титруването на хемолитична серум и в титруването на комплемента.

Комплемента схема титруване без антиген

ТАБЛИЦА 6
Схема титруване на комплемента в присъствието на антиген

Освен това е препоръчително да се титрува допълнение при наличието на антиген.
Титруване на комплемента в присъствието на антиген необходимо в случаите, когато антигенът инхибира комплемента титър (антикомплементарна антиген имот). Това свойство може да зависи както от природата на антигена и на метода за неговото получаване.

1. Антиген. фиксиране на комплемента, използвайки различни антигени. Антигени са разнообразни микробна култура или екстракти от анормални или нормални тъкани. Както бактериален антиген може да бъде използвана за микробиална суспензия във физиологичен разтвор, и микробни екстракти се получат по различни начини (например, antiforminovy ​​гонококов антиген туберкулозен алкохол и т. П.). Добри антигенни свойства микробен суспензия има предварително двойки формалин убити или лекувани с алкохол. За реакцията на изходния суспензия се разрежда антиген на оптичен стандарт, съдържащ. 1 млрд. Микробните органи в 1 мл, и взети в обем от 0.5 мл.

Както е използван микробен антиген лизат в дестилирана вода или физиологичен разтвор, получен в shyuttel апарат (шейкър) или чрез третиране antiforminom.
Към реакционната смес трябва да се използва като антиген доза, която води до цялостното забавяне хемолиза със серуми, съдържащи подходящо хемолизин, но която се не забавя хемолиза. По силата на факта, че всички микробни антигени се адсорбират определено количество на комплемента, преди тяхното титруване тествани за антикомплементни свойства, определяне разтваряне доза допълнение, т.е.. Е. най-голямата сума на антиген, който не предизвиква забавяне на хемолиза. Определяне на антиген разтворител такива дози, произведен от схема (таблица. 7).
От таблицата се вижда, че в този пример антиген доза разтворител е 0,4 мл. За експеримента, да половин доза, т. Е. е приблизителната доза е 0.2 мл.

1. серум тест. серуми пациент се разделят от съсирека от 3-48 часа след кръв и инактивиран във водна баня при 56 ° в продължение на 30 минути.

Таблица 7 определяне на дозата верига разтваряне антиген

Инактивиран серум може да се съхранява в хладилник за 5-6 дни. За реакцията на серум на пациента се използва при разреждане от 1: 5 (0.1 мл серум + 0,4 мл физиологичен разтвор).
Формулировка опит за свързване на комплемента (таблица. 8).
За да се постави за свързване на комплемента са необходими следните съставки:

1. физиологичен разтвор (0.85%);
2. серум да се разгледа, инактивиран при 56 ° в продължение на 30 минути във водна баня;
3. антиген (суспензия от бактерии или екстракт от тях), без да причинява хемолиза нито независимо нито забавяне на титруване на дозата инсталиран;
4. допълва в титруването работната доза инсталиран;
5. хемолитична серум в доза, съответстваща на три пъти титъра;
6. 3% суспензия от овчи еритроцити.

Всяка от съставките, които се използват за реакцията се взема в количество от 0.5 мл. Ако дозата на отделните компоненти е по-малко от това количество, след това си комплемент физиологичен разтвор до 0,5 мл.
Основната фиксиране опит допълнение е желателно да се постави само 2-3 антигени получени по различни начини (А1, А2, А3 в Таблица 8.).

Шофиране опит първична

За контрол на реакцията в същото време е необходимо да се постави в абсолютно същите условия, с нормален серум и серум умишлено дава положителен резултат. Когато реакцията е първата смесена формулировка от серум, антигена и комплемент. Сместа се инкубира при 37 ° в продължение на един час. След това сместа се добавя към епруветка и хемолитична еритроцитите серум - хемолитична система. Хемолитична система се добавя директно или след смесване на равни обеми серум хемолитични еритроцити и след половин час или поддържане на сместа в термостат. Сместа на всички съставки След енергично разклащане се поставя в термостат при 37 ° в продължение на 1 час, и след това се прехвърля в продължение на 12 часа в хладилник или оставя при стайна температура.
Тръбите, в която е настъпило хемолиза, течността става прозрачен, но оцветени (вж. Фиг. 58).

Фиг. 58. свързване на комплемента верига.
и - реакционната polozhitelnaya- б - отрицателна реакция.