Lab оборудване - рубеола

Видео: лабораторна стъклария

Получаването на антисеруми. Техника получаване на антисеруми за вирусни антигени, описани подробно Habel и Залцман (1972). Най-удобни за животните серум срещу вируса на рубеола, както и срещу повечето вируси, е заек. Най-честата схема immunizatsii- тройна въвеждане в ушната вена с 5 мл вирус-съдържаща течности с интервали от 2-3 седмици. Зайците бяха обезкървени една седмица след последната инжекция. културалната течност се използва за имунизация не трябва да съдържа големи количества протеин. За да се подготви като течен монослой от инфектираните клетки внимателно се промиват от предходната среда и след това се въвежда поддръжка среда, която не съдържа серум, който се използва за имунизация.
В нашата лаборатория, за да произвеждат големи количества от суроватка, използвана успешно овце (RG Desyatskova, EF Opochinsky, 1973). Имунизациите са извършени в три екземпляра, като се използва щам на вируса на рубеола-2 Sp. Когато първата и втората имунизация, вирусът се инжектира във вената едновременно и интрамускулно в доза от 3,3 8,1H108 PFU, а третият - само интравенозно в доза 4,2H108 PFU. Интервалите между първия и втория администрирането на вируса са на 3 седмици, а между втората и третата - 1 седмица. Животното обезкървени 7 дни след последната инжекция. Antigenagglyutininov титри в серума е 512-1024.
Изолиране и идентифициране на вируса на рубеола. На практика, вирусолог да се наложи да се изолират вируса от носа или кръв рубеола пациента. В нашата лаборатория, използването на специална техника и последващата идентификация на вируса на рубеола, губя RG Desyatskovoy.
Тампоните с назофарингеален освобождаване поставят в стерилни епруветки, съдържащи 3 мл Ханкс "разтвор, съдържащ 0.5% желатин, 1000 U / мл пеницилин, 500 U / мл стрептомицин и 20 U / мл нистатин. Манипулация като слуз от носа трябва да бъде energichno- желателно като слуз от носа, което се добавя във всяка ноздра за няколко минути памучен тампон. Кръв беше взета от пръст или от вена в епруветки с хепарин сухо. Пробите се транспортират до лабораторията в лед и в случай на необходимост преди изследването се съхраняват при -40 °.
Засяването се извършва върху проби от епруветка култура на RK13 клетки. Разсаждане клетки при всяка доза на епруветката бе 120 000-150 000 клетки в 1 мл среда 199 съдържаща 10% говежди серум. Инокулацията се извършва след формирането на монослой, обикновено в 3-4 дни. Към всяка епруветка се прибавя 0,5 мл материал от назофаринкса и кръвта от 0.1 мл. На всяка проба, взета 3-4 тръби. След един час на контакт при стайна температура в тръбата се прибавя 1 мл среда 199 с 6% от нагрята лекувани каолин говежди серум и се инкубира при 35 ° С. За да се адаптира и натрупване на вирусни посят култури били слепи пасаж 3-4 на всеки 8 до 10 дни.
Индикация и идентификация на рубеола вирус се извършва чрез намесата с вируса на везикуларния стоматит (VSV) в същата клетъчна култура. Разрешаването на Би Би Си на вируса в доза от 100-320 TCD 50 са направили 7-9 дни след заразяването с изследваното средство. Реакцията води след 48-96 часа под внимание, когато тръбите за контрол, позволяващи вирус, причинени ясно дегенерация. В култури, които проявяват резистентност към действието на военновъздушните сили можеше да говори за наличие на вирусен намесва агент. ,
За идентифициране на отделни вирусни щамове, използвани хиперимунен серум овце, имунизирани с рубеола вирус (см. По-горе). Можете също да използвате анти-серум от всякакъв произход. Серумът се разрежда 1: 8 се смесват с равен обем на вируса на тест при разреждане от 1: 10 и се инкубират в продължение на 2 часа при стайна температура. Среден служи разреждане на 0.5% лакталбуминов в разтвор разтвор на Ърл. Към всяка епруветка култура RK13 клетки се прибавят към 0.2 мл серум и вирус и се инкубират в продължение на един час при стайна температура (културална течност, преди да се отстранява). Епруветките след това добавени към 199 среда, съдържаща 2% каолин третира говежди серум и културата се инкубира при 35 ° С. След 7 дни инкубация, културалната течност се отстранява и епруветките се добавят мл вирус в доза, позволяващ 100-320 TCD50 разрежда със същата среда. Реакцията се счита след появата на дегенерация в контрола клетъчна култура. Наличието на цитопатичен ефект в експерименталната култура на доказателства на вируса специфично неутрализиращо серум. Едновременно, серумът се изследва за токсичност и доза се наблюдават работи толерантен вирус.

Нашата лаборатория е била успешно приложена към "класическия" начин за индикация и идентификация на вируса на рубеола използване на първични култури от бъбрек зелена маймуна и като позволява на вируса на ECHO и (Паркман д. А., 1964b), обаче, по наше мнение, тази техника не е подходящ за обичайната практика на вирусологията.
идентификационни методи, основани на пряко наблюдение на цитопатичния ефект на вируса на рубеола, се използват рядко за откриване на циркулиращите щамове на вируса, като "диви" щамове поначало не се цитопатичен ефект в областта на културата, без предварително адаптация. Проявите CPP рубеола вирус обикновено доста придирчиви и често зависи от щамовете клетка, серия от медии, серуми и др Д., която ни даде основание да се препоръча за изолиране на вируса индиректен метод.
Титруване на вируса. Рубелла титри на вируса на двете индиректен метод на базата на намесата и директен, въз основа на цитопатичния ефект наблюдаван директно. Индиректен метод на титруване може да се използва процедурата, описана по-горе в описанието на вирусен индикация. Необходимо е само да се включи етап на подготовка на десетични разреждания на вируса. Като среда за поддръжка след инокулация на клетъчни култури в различни разреждания на вируса използва среда 199 съдържаща 2% каолин третира говежди серум. За титър, като най-високото разреждане, който защитава 50% от заразените култури от дегенерация, причинена толерантен вирус. Вирусните титри са изразени InDso / мл (интерфериращи доза).
За титруване на вируса чрез директния метод, използвайки клетъчни култури са изложени на рубеола вирус СРЕ. Най-често това е RK13 (Hopps д. А., 1969), по-малко Sirk и ВНК21. Обикновено епруветката, съдържаща култура с пипета 0,2 мл от съответните десеткратни разреждания на вируса и след контакт в продължение на един час при стайна температура среда поддръжка. За като най-високата титър разреждане на вируса на цитопатичен ефект прави 50% от инокулираните култури (TCD50).
В изследователски лаборатории за титруването на рубеола вирус е широко използван от плаката за анализ. Най-често се използва за тези цели RK13 клетки. За практически лаборатории, този метод е малко по-сложно, така че няма да се даде подробно описание и ограничават съответните връзки (RG Desyatskova, OG Andzhaparidze, 1968- Hopps д. А., 1969).
Серологични изследвания. Изолиране на вируса на рубеола - много процедура отнема време и е малко вероятно да бъде широко разпространена. От практическа гледна точка, много по-голяма стойност са серологични тестове. Можете да ги използвате в продължение на няколко дни, за да се потвърди диагнозата на рубеола, разследва имунния статус на определена група от населението, за да се установи ефективността на ваксинациите и така нататък. Д. антитела срещу вируса на рубеола са открити в реакциите на неутрализация (рН), инхибиране на хемаглутинацията (HI), свързване на комплемента ( RAC) и имунофлуоресценция (IFA). На практика най-разпространената HIT поради своята простота, специфичност и скорост на получаване на резултати. Тук е подробно описание на тази реакция.
хемаглутинацията инхибиране. HI рубеола вирус описан за първи път от Stewart и др през 1967 г. Ние сме намерили начин за отстраняване на топлоустойчив серум хемаглутинационни инхибитори рубеола вирус, които са |. 3-липопротеини. За тази цел, серума, използван в реакцията, се третира с 25% суспензия на каолин. В нашата лаборатория се използва главно леко модифициран метод на тези автори. Проучване на повече от 10 000 серуми, можем да препоръчаме този метод, както е съвсем точна и най-достъпни за вирусология лабораторията на страната ни.
Като разтворител разтвор на декстроза, желатин веронал буфер (JW).
Каолин. 25% каолин суспензия се получава от Кларк и Casals (1958), чрез метода на изпиране четирикратно във фосфатен буфер рН 7,2 разтвор. Порция от 250 г каолин се смесва с 750 мл буферен разтвор, разклащат енергично и се оставя да се утаи. След смяна процедура супернатанта се повтаря с пресен разтвор. Крайната суспензия се автоклавира в продължение на 30 минути при 115 атм. и след това се съхранява при 4 ° С. Преди употреба, разтвор на фосфатен буфер се заменя със същото количество DZHV.
Еритроцитите. Предпочитаме червените кръвни клетки на възрастни гълъби, но също така да еднодневни пилета еритроцитите. При пилета са обезкървени чрез обезглавяване и от донори гълъби - от сърцето. В този случай гълъб едновременно вземат 5 мл кръв в спринцовка с 5 мл Alsevera разтвор. Кръв до употреба (обикновено в рамките на една седмица) се съхранява в разтвор Alsever е в съотношение от 1: 10, 1: 20. Преди използват еритроцити се филтрува и се промива три пъти в десетократно количество DZHV чрез последователно центрофугиране за 10 минути при 1200 об / мин. От утайката получава 0.25% еритроцитна суспензия за реакцията и суспензията е 50% за лечение на серумите.
серуми обработка. серуми тест, за да се отстранят неспецифични инхибитори за предотвратяване на спонтанен аглутинация и се нагрява при 56 ° в продължение на 30 минути и се обработва с каолин и еритроцити. Към 0.1 мл нагрява суроватка се прибавя 0,3 мл суспензия каолин 25% и се инкубира сместа при стайна температура в продължение на 20 минути, като се разклаща енергично няколко пъти. След това, сместа се центрофугира в продължение на 15 мин при 2000 об / мин и без смучене супернатантата, се прибавят 0,05 мл 50% еритроцитна суспензия. След един час на контакт при 4 °, по време на която червените кръвни клетки трябва да бъдат 2-3 пъти леко разклатени, сместа се центрофугира отново при 1500 об / мин за 10 минути. Центрофугирането процедура може да бъде заменен от инкубиране при 4 ° С една нощ. серум супернатанта се разрежда 1: 4.
Отчет за болнични инфекции. Реакцията се провежда в макро- и micromodifications. При формулирането реакционни makrometodom панели са пластмасовите ямки с вместимост 1,5 мл. Mikrometodiku извършва с помощта микротитърно Такач фирма "Metrimpeks" (Унгария). В титруването на подготовка антиген работа еритроцитна суспензия и разреждания на серуми тест използва DZHV съдържащ 0.2% говежди албумин да се добави за стабилизиране на реакцията. При липса на албумин от говежди възможно да се използва хуманен плазмен албумин, глобулин, получени от производството на отпадъци, плазма или албумин разтвор за интравенозно приложение (Desyatskova G. R. и др., 1971).
Тъй макро- и микро-осъществява идентично, описание makroreaktsii, а обемът на съставките, въведена в микро-, поставени в скоби. Когато антигенът се титрира за да се определи дозата операционна двукратни разреждания от 0.4 (0.05) 0.25 ml-% еритроцитна суспензия се въвежда в обем от 0,2 (0,025) мл. Всички съставки се охлаждат
Дайте да 0грама. в ледена баня. Резултатите дават възможност за 1.5-2 часа инкубиране при 4 ° С. На разреждане на антиген в микро-добре да се използва микропипета. За антиген титър взема най-високото разреждане, което причинява слепването важно. Работа доза от антиген HI на формулировка съдържа 4 единици.
Двукратни разреждания на изпитвания серум се провежда в обем от 0,2 (0,025) мл. За всяко разреждане серум се прибавя 0,2 (0.025 мл) работно разреждане на антигена, сместа се оставя да престои в продължение на един час при стайна температура и след това се прибавя 0,2 (0,025) мл 0,25% еритроцитна суспензия охлажда в лед. Реакционната смес се оставя в продължение на 2-3 часа инкубиране при 4 ° С.
При формулирането на реакционната микрометод серумен антиген-добър контакт и държат при 4 ° С в продължение на 2 часа, като резултатите от реакцията се извършва по този метод, до голяма степен зависят от спазването на режима на охлаждане.
Серум титър се смята за най-високата хемоаглутинацията разреждане напълно поразителен. Серумът се счита за отрицателен в случай, потискането на аглутинация не се наблюдава при разреждане 1: 8.
Всяка серия титруване се придружава от подходящи контроли: титруване на имунен серум с известен титър на антителата отрицателен серум, контролен серум и червени кръвни клетки в присъствието на спонтанно аглутинация. През последните две контроли, липсата на подходящи компоненти компенсира подходящ обем на JW. Желателно е да се използва двойно дестилирана вода.
В момента не съществува стандартна методология за определяне на HI вирус на рубеола, което щеше да изравни на резултатите, получени в различните лаборатории. Няколко модификации на тази реакция, същността на което се състои основно в използването на различни методи на лечение серуми да се отстранят неспецифични инхибитори, както и използването на различни буфери и еритроцити.
Освен отстраняване инхибитори чрез адсорбция върху каолин, широко използван утаяване серуми със смес от хепарин и манганов хлорид (Cooper напр. A., 1969a) и наскоро установи обработка серуми приложение със смес от сулфат на декстран и калциев хлорид (DS-C) (Haukenes, Aasen, 1971 г.).
Като буферни разтвори, с изключение DZHV използват боратен буфер с 0.4% албумин (Бабс) - Същият разтвор се смесва с фосфат буфериран физиологичен разтвор (PBS Бабс +) (.. Халонен ти, 1967) и наскоро и HEPES буфер или HEPES албумин и желатин (HSAG) (Schmidt напр. с., 1971).
Интересно, някои нови предложения HAI модификация. По този начин, Gupta и Peterson (1971), разработена техника за прилагане формалин еритроцити използва нов буфер система- Schmidt и Dennis (1972), използван човешки еритроцити група 0, имащ редица предимства в практическото primenenii- Куин и сътр. (1972), предложен от трипсин лечение на човешки еритроцити която увеличава тяхната чувствителност и ще открие нови възможности за стандартизирането на реакцията.
Нарастващото използване на получава тествани за серум макроглобулин (IgM антитела, 19S). Този тест може да се потвърди диагнозата на рубеола в един ден, тъй като наличието на специфични IgM в серума е индикация за текущата инфекция. Най-простият метод за определяне на IgM, въпреки че най-малко точни, е за лечение на серуми от 2-меркаптоетанол (2-Ме) (RG Desyatskova, Е. F. Opochinsky, 1973 Banatvala напр. A., 1967).
Серумът се обработва с 2-МЕ (крайна концентрация на 2-МЕ - ODM) за един час при 37 ° С и след това се изпитва в HAI извършва по обичайния начин. Успоредно с това, същата серумът се титрира, но не се обработва с 2-МЕ. 2-МЕ разрушава IgM и поради разликата в титри на антитела, определени в серумни проби, взети преди и след третиране с 2-МЕ може да се съди
наличие на IgM. Тя се счита за автентичен с най-малко четири пъти разлика в кредитите.
По-сложни методи за идентифициране макроглобулин са центрофугиране в захарозен градиент (Field, Murphy, 1972), гел филтрация (Burgin-Wolff напр. A., 1971) и индиректна имунофлуоресценция (Haire, Hadden, 1972), но тези методи не са достатъчно полезни в широк практика, защото на тяхната техническа сложност. Поради тази причина, ние не ще даде подробно описание и с позоваване на ограничаване на откриване на антитела срещу от реакцията на неутрализация (Паркман напр. A., 1964- Furesz напр. A., 1969 Kobayashi напр. A., 1973), свързване на комплемента ( Север напр. с., 1965) и чрез имунофлуоресценция (Brown напр. с., 1964).
В момента съществува ясна необходимост от разработване на стандартна методология за определяне на серологични тестове (най-малко болнични инфекции) и в производството на стандартни компоненти за своите продукции, които ще увеличат точността на резултатите и значително ще опрости провеждането на масови серологични изследвания.

Видео: Немироф - стъкло, петриево блюдо и епруветка 2 в 1

Видео: Лабораторно оборудване и стъклария 31